癃闭舒片提取工艺优化和含量测定方法研究*

上海奥星制药技术装备有限公司 王国振 赵 海 张 闯 石 红(上海201600)

癃闭舒片是由补骨脂 、益母草、金钱草、海金沙、琥珀及山慈菇六味药物组成的复方制剂 ，原工艺采用琥珀原粉入药，其余补骨脂等五味药材加水煎煮，浓缩，喷雾干燥，与琥珀原粉及适量辅料制得片剂。该药的君药为补骨脂，其有效成分为补骨脂素和异补骨脂素，原工艺提取补骨脂中补骨脂素和异补骨脂素收率偏低，因此对原工艺进行改进制得癃闭舒片。为了进一步控制其质量，采用高效液相色谱法对制剂中补骨脂素和异补骨脂素含量进行了测定，现报道如下。

1 试药与仪器

高效液相色谱仪 (UltiMate 3000美国DIONEX公司);N-2000色谱工作站 (浙江大学);TU-1900紫外分光光度计 (北京普析通用仪器有限公司);癃闭舒片 (石家庄科迪药业有限公司);补骨脂素对照品 (批号:110739–200910，中国药品生物制品检定所);异补骨脂素对照品 (批号:110738-200811，中国药品生物制品检定所);乙腈和甲醇为色谱纯;水为超纯水;其它试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 提取工艺优化

2.1.1 色谱条件:色谱柱，Kromasil 100A C185 μm 4.6×250 mm;柱温:室温;流动相:甲醇-水 (55︰45);流速:1.0 mL/min;检测波长:246 nm;理论塔板数以按补骨脂素峰计算应不低于5 000。

2.1.2 标准曲线的绘制:补骨脂素分别配成5.2、10.4、20.8、41.6和83.2μg/mL溶液，异补骨脂素分别配成5.1、10.2、20.4、40.8和81.6 μg/mL溶液。分别精密量吸取上述对照品溶液各10 μL，在上述色谱条件下，分别进样分析，记录色谱图，测定峰面积。以对照品进样量 (μg)为横坐标，以峰面积值为纵坐标作图，得到:补骨脂的回归方程为:Y=895 462X-16 859，r=0.999 9，在0.052～0.832 μg范围内，补骨脂素进样量与峰面积值呈良好的线性关系;异补骨脂的回归方程为:Y=76 295X-86 904，r=0.999 9，在0.051～0.816 μg范围内，异补骨脂素进样量与峰面积值呈良好的线性关系。

2.1.3 供试品的制备:取相当于0.5 g药材的提取液，蒸干，加甲醇适量溶解，转移置具塞容量瓶中，精密加甲醇至25 mL，密塞，称定重量，超声处理30 min，放冷，称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液5 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜 (0.45 μm)滤过，取续滤液，即得。

2.2 单因素考察和正交优化提取工艺 原工艺:补骨脂、益母草、金钱草、海金沙及山慈菇五味药材加水煎煮，浓缩，喷雾干燥，与琥珀原粉及适量辅料制得片剂。新工艺:补骨脂单独乙醇提取，回收乙醇至无醇味，备用;益母草、金钱草、海金沙及山慈菇四味药材与补骨脂药渣加水煎煮，滤液与上述浓缩液合并浓缩，喷雾干燥，与琥珀原粉及适量辅料制得片剂。

2.2.1 单因素考察:(1)提取次数对指标成分影响，将提取时间固定为1 h，加乙醇量为8倍，分别提取1、2、3、4，5次，考察了不同提取次数对指标成分的影响。结果在提取3次以后，补骨脂素和异补骨脂素含量很少，因此最多提取3次。(2)提取时间对指标成分影响，将提取次数固定为3次，加乙醇量为8倍，每次分别提取0.5、1、1.5、2 h，考察了不同提取时间对指标成分的影响。结果每次提取1 h，补骨脂素和异补骨脂素含量基本提取完全，因此每次提取1 h。(3)溶剂用量对指标成分影响，将提取次数固定为3次，提取时间为1 h，每次分别加6、8、10、12倍量乙醇，考察了不同溶剂用量对指标成分的影响。结果溶剂用量对指标成分影响不大，考虑生产成本，选择8倍量乙醇。(4)乙醇浓度对指标成分影响，将提取次数固定为3次，提取时间为1 h，加8倍量乙醇，分别用50%、60%、70%、80%乙醇提取，考察了不同浓度的乙醇对指标成分和出膏率的影响。综合评价后70%乙醇提取效果基本完全。

2.2.2 正交设计筛选最优提取工艺:称取100 g补骨脂药材9份，结合文献及单因素预试验，选定补骨脂素和异补骨脂素为考察指标成分，运用正交试验的方法，对主要影响因素:加乙醇量 (A)、时间 (B)、次数 (C)、醇提浓度 (D)考察。

2.2.2.1 实验设计:［1］运用正交设计试验，以补骨脂素和异补骨脂素为考察指标成分，结合文献、工业生产及预试验，确定4因素3水平，见表1。

表1 提取条件因素-水平设计

2.2.2.2 方法与结果:按表1设计操作，按供试品处理下列样品即得。结果见表2。

表2 正交试验结果

2.2.2.3 结果分析:对试验结果进行方差分析，见表3。

表3 方差分析表

由表2直观分析表可知，各考察因素对补骨脂素和异补骨脂素影响大小顺序为C＞B＞D＞A;表3方差分析，表明提取时间和提取次数对补骨脂素和异补骨脂素的含量影响显著，因此选择提取3次，每次1.5 h;直观分析，醇提浓度和溶剂用量对补骨脂素和异补骨脂素的含量影响不大。因此选择醇提浓度为60%和80%时，含量相差不大，考虑生产成本，因此选定60%乙醇提取，溶剂用量选择6倍量乙醇;因此，最后确定工艺为:回流提取3次，每次1.5 h，每次加6倍量乙醇，醇提浓度为60%。并验证结果，见表4。

表4 工艺比较表

提取工艺确定:补骨脂单独乙醇提取，回收乙醇至无醇味，备用;益母草、金钱草、海金沙及山慈菇四味药材与补骨脂药渣加水煎煮，滤液与上述浓缩液合并浓缩，喷雾干燥，与琥珀原粉及适量辅料制得片剂。

2.3 成品中补骨脂素与异补骨脂素含量测定［2］

2.3.1 色谱条件与系统适应性:色谱柱，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;柱温，25℃;流动相，乙腈-水 (32︰68);流速，1.0 mL/min;检测波长，246 nm。理论板数按补骨脂素峰计算应不低于5 000。

2.3.2 干扰性试验:按照处方制备不含补骨脂的阴性样品，按拟定的含量测定方法制备阴性对照液，进样分析，结果在对照品溶液和供试品溶液补骨脂素和异补骨脂素峰相同保留时间位置阴性未见有峰干扰，说明癃闭舒片中其他药材及辅料对本方法测定补骨脂素和异补骨脂素的含量无干扰。

2.3.3 线性关系试验: (1)对照品溶液制备，分别取补骨脂素对照品适量，精密称定，加甲醇制成浓度为2.6、5.2、10.4、20.8、41.6 μg/mL的溶液;分别取异补骨脂素对照品适量，精密称定，加甲醇制成浓度为2.7、5.4、10.8、21.6、43.2 μg/mL的溶液，分别吸取上述两种对照品溶液下不同浓度补骨脂素异和补骨脂素10 μL，进样分析。(2)标准曲线，在上述色谱条件下，记录色谱图，测定峰面积。以补骨脂素和异补骨脂素对照品进样量 (μg)为横坐标，以峰面积值为纵坐标作图，得到:①补骨脂素回归方程为，Y=171 627X-25 325，r=0.999 9，在 0.026 ～0.416 μg范围内，补骨脂素进样量与峰面积值呈良好的线性关系。②异补骨脂素回归方程为，Y=324 556X-187 905，r=0.999 9，在 0.027 ～0.432 μg范围内，异补骨脂素进样量与峰面积值呈良好的线性关系。

2.3.4 精密度试验:精密吸取含补骨脂素和异补骨脂素分别为10 μg/mL的对照品溶液10 μL，重复进样6次，测定其峰面积，结果见表5、表6。

表5 补骨脂素对照品精密度试验结果

表6 异补骨脂素对照品精密度试验结果

试验结果表明:精密度良好，补骨脂RSD为0.39%，异补骨脂RSD为1.3%。

2.3.5 溶液稳定性试验: 称取样品约0.3 g，精密称定，照确定的方法制备供试品溶液，取上述供试液，分别于0、2、4、8和14 h时，进样10 μL，测得样品中补骨脂素和异补骨脂素峰面积，结果见表7、表8。

表7 供试品溶液补骨脂素稳定性试验结果

表8 供试品溶液异补骨脂素稳定性试验结果

试验结果证明，样品溶液在14 h内基本保持稳定。

2.3.6 重复性试验:按拟定的含量测定方法，对同一批样品，分别制备5份供试品溶液，分别进样10 μL，测定峰面积值总和并计算含量，结果见表9。

表9 样品重复性试验结果

2.3.7 回收率试验:称取已知含量的样品约0.15 g，平行9份，其中3份分别加入浓度为含0.25 mg/mL补骨脂素和异补骨脂素对照品溶液各1 mL，3份分别加入含0.4 mg/mL补骨脂素和异补骨脂素对照品溶液各1 mL，3份分别加入0.55 mg/mL的补骨脂素和异补骨脂素对照品溶液各1 mL，照“供试品溶液制备”项下操作，测定，以下式计算方法的回收率，结果见表10。回收率%=测得总量-样品含量/加入量×100%。

表10 回收率试验结果

试验结果表明:平均回收率为100.17%，RSD为1.6%，加样回收率良好。

3 讨论

补骨脂在癃闭舒片中作为君药，其主要有效成分为补骨脂素和异补骨脂素，因补骨脂素和异补骨脂素是脂溶性成分，采用水提取补骨脂中补骨脂素和异补骨脂素，收率偏低，影响药效;笔者采取单独乙醇提取补骨脂中补骨脂素和异补骨脂素，补骨脂药渣与其他药材合并水提取，这样每片癃闭舒片中含有补骨脂素和异补骨脂素含量总和比原工艺比较提高25%，药效试验正在进行中。

［1］国家药典委员会.中国药典 (一部)［S］.北京:化学工业出版社，2010.1 226-1 227

［2］周海婴.RP-HPLC柱前衍生法测定复方甘草酸铵S分散片的含量 ［J］.吉林医学，2009，30(12):28-30