HPLC法测定豆腐黄浆水中有机酸质量浓度

李 健，吕 博，刘 宁，黎晨晨

(哈尔滨商业大学食品工程学院黑龙江省高校食品科学与工程重点实验室，哈尔滨150076)

豆腐黄浆水是豆腐生产过程中的副产物，又称豆腐废水，主要来源于热豆浆凝固、制坯压榨出来的泔水.由于黄豆中含有可溶于水的黄酮和胡萝卜素类色素，在磨豆、凝固、制坯过程中少量的黄色素被带到泔水中，使泔水呈黄色，所以也称为黄泔水［1］.豆腐黄浆水中含有大量营养素，其中蛋白质质量分数为0.377%，总糖质量分数为0.313%，其中还原糖质量分数为0.10%、粗脂肪质量分数为0.06%、大豆异黄酮质量分数为0.014%，钾质量分数为0.048%钠质量分数为0.03%，镁质量分数为0.01%，钙质量分数为0.01%，磷酸根质量分数为0.08%，氯质量分数为0.035%.此外，黄浆水中还含有维生素P、K及其他营养成分［2］.江南等地利用黄浆水作为凝固剂制作豆腐有悠久的历史.浆水富含有机酸，其有机酸的质量分数和种类维持浆水的酸碱平衡，影响浆水的口感以及生物稳定性［3－4］.通过一定技术手段将豆腐黄浆水充分利用起来，不仅减少了处理这些副产物的工序和成本，更是变废为宝，提高资源利用率.因此，本实验采用高效液相色谱法对黄浆水中的有机酸及其质量分数进行分析，为发酵黄浆水制备豆腐凝固剂奠定了基础，为改善豆腐品质提供了依据，提高了资源利用率.

1 材料与方法

1.1 试验材料

同一批次豆腐黄浆水:市售.

1.1.1 主要仪器与设备

Agilent液相色谱仪(配备紫外检测器)，美国安捷伦公司;TU－1901双光束紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司;分析天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司;酸度计，上海精密科学仪器有限责任公司;离心机(型号LD4－2A)，北京医用离心机厂;超声波清洗器(型号AS3120A)，AUTO SCIENCE;针头过滤器，美国安捷伦公司;0.45μm合成纤维树脂滤膜;超纯水机(Ultra Pure)，上海和泰仪器有限公司.

1.1.2 试剂

甲醇(色谱纯)，山东禹王实业有限公司禹城化工厂;磷酸(质量分数≥85.0%)，天津市永大化学试剂有限公司;磷酸二氢钾(分析纯)，天津市天力化学试剂有限公司;苹果酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸、草酸、富马酸标准品，成都瑞芬思生物科技有限公司;试验用水为重蒸水，经0.45μm滤膜真空抽滤.

1.2 试验方法

1.2.1 流动相的配制

0.01 mol/LKH2PO4－H3PO4缓冲溶液:取85%浓磷酸34 mL溶于重蒸水中，定容至500 mL容量瓶中备用.称取KH2PO40.682 2 g，用重蒸水溶解并定容至500 mL容量瓶中.用磷酸调pH值至2.85，然后用0.45μm水相滤膜过滤，临用前用超声波脱气.

1.2.2 有机酸标样的配制

分别准确称取草酸20 mg、酒石酸20 mg、苹果酸20 mg、柠檬酸20 mg、琥珀酸20 mg、富马酸20 mg，用重蒸水溶解并分别定容到6个10 mL容量瓶中，得到质量浓度为2 mg/mL的标准酸原液，密封置于4℃冰箱中保存待用，按照表1配制混合酸标样.

表1 混合标准溶液中6种有机酸的质量浓度

1.2.3 样品处理

取豆腐黄浆水10 mL，经过滤后用离心机在4 000 r/min 下离心 20 min［5］，取上清液 1 mL，经0.45μm滤膜过滤，超声脱气后供分析用.

1.2.4 色谱条件

Agilent Eclipse XDB －C18色谱柱(4.6mm ×150mm，5μm);检测器为紫外检测器，检测波长为210 nm;流动相为甲醇∶0.01 mol/L KH2PO4－H3PO4缓冲溶液(3∶97，pH 值为2.85);流速为0.8 mL/min;柱温为25℃;进样量为20μL.

1.2.5 有机酸定性定量方法

有机酸采用保留时间定性，外标法定量.

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

2.1.1 紫外检测波长的确定

采用紫外可见分光光度计采集6种有机酸的吸收光谱图，如图1所示，苹果酸在192 nm处出现吸收峰，但在210 nm处也有吸收.草酸、柠檬酸、酒石酸、富马酸均在波长越小，吸收越强.琥珀酸分别在191 nm、214 nm处有最大吸收峰.综合六种有机酸的吸收程度选择210 nm为检测波长.

图1 有机酸紫外吸收光谱图

2.1.2 流动相的确定

反相高效液相色谱法中，流动相一般以极性强的液体为基础溶剂，并加入甲醇等极性调节剂.甲醇的性质及其与基础溶剂的混合比例对溶质的保留值和分离选择性有显著的影响.多数缓冲溶液在210 nm左右均有吸收，但是磷酸盐缓冲溶液作为一种弱酸电离抑制剂在210 nm左右几乎无吸收，分离效果好，故可以作为本试验分析有机酸的流动相，所以本试验选择KH2PO4作为缓冲溶液.由于缓冲溶液质量浓度越高，酸的存在形式就越稳定［6］，但是较高质量浓度的缓冲盐溶液离子强度大，对组分分离不利，对泵和色谱柱的寿命都有一定的影响，降低了灵敏度，而较低的质量浓度又不利于分离，所以选择0.01 mol/L的缓冲盐溶液.本试验采用甲醇－磷酸盐缓冲溶液作为流动相.甲醇与磷酸盐缓冲溶液比例分别为 1∶99、3∶97、5∶95.分析不同比例的甲醇与磷酸盐缓冲溶液的配比对混合有机酸的分离效果的影响，并且随着甲醇的加入，有机酸的疏水端基团和固定相间的相互作用减弱，有机酸保留时间降低，并可以改善色谱峰型［7］，当甲醇:0.01mol/L KH2PO4-H3PO4缓冲溶液=3∶97时，六种有机酸分离效果和峰型较理想.

2.1.3 流动相pH值的确定

流动相的pH值对有机酸的分离有较大的影响，通过调节流动相的pH值可以抑制解离，增加保留时间［8－9］，所以本试验对流动相的pH值进行了确定，用 H3PO4调节流动相的 pH值分别为2.80、2.85、2.90、2.95 和3.00，各有机酸保留时间如图2所示.在pH值为2.8时草酸、酒石酸分离效果较差;pH值为2.95和3.0时，苹果酸、富马酸保留时间相近，不能有效的分离.由于pH值小于2.8的溶液会影响色谱柱的寿命，所以选择用KH2PO4－H3PO4(pH值为2.85)缓冲溶液作为流动相.

图2 pH值对有机酸保留时间的影响

2.1.4 流速的确定

流动相的流速影响出峰时间，本试验讨论了流速分别为 0.4 、0.6、0.8、1.0 mL/min 下有机酸的分离效果，随着流速增加，有些成分不能完全分离;流速降低，会造成托峰现象，导致两相邻成分分离效果不好.又由于流速为1.0 mL/min时，有机酸分离效果较差，柱压升高，降低色谱柱寿命，因此选择流动相流速为0.8 mL/min.

2.1.5 柱温的选择

色谱柱的柱温对有机酸的分离、保留时间有一定的影响，随着柱温的升高，各有机酸的保留时间降低，但是对峰型和分离效果的影响不大.因此，选择柱温为25℃.

2.2 混合有机酸标准溶液的分析

根据上述确定的最佳色谱分离条件为:检测波长为210 nm;流动相为甲醇∶0.01 mol/L KH2PO4－H3PO4缓冲溶液(3∶97，pH 值为 2.85);流速为0.8 mL/min;柱温为25 ℃;进样量为 20 μL.在此色谱条件下，各种有机酸得到有效的分离(如图3所示).

2.3 有机酸线性回归方程、相关系数、检出限

取各不同质量浓度的混合标准溶液以20.0 μL进样量进行分析，以各种有机酸质量浓度为横坐标，混合标准品峰面积为纵坐标进行线性回归分析，得到6种有机酸标准品的线性回归方程和相关系数.以信噪比等于3为标准，测得草酸、柠檬酸、苹果酸、酒石酸、琥珀酸和富马酸检出限列于表2.

图3 有机酸标准溶液色谱图

表2 6种有机酸的线性回归方程、相关系数及检出限

2.4 精密度与重复性试验

从同一批次的豆腐黄浆水中平行取5份样品进行精密度与重复性试验，各种有机酸质量浓度、标准偏差、变异系数结果如表3、4所示.可见，本方法的重现性较好.但存在偶然误差，影响了样品的分离，重现性也受到影响.此情况可以通过多次测量来解决.

表3 豆腐黄浆水各种酸精密度试验结果

表4 豆腐黄浆水各种酸重复性试验结果

2.5 豆腐黄浆水色谱分析

按照1.2.3处理后的样品进行分析，结果如图4所示.

图4 豆腐黄浆水中有机酸色谱图

3 结论

1)由上述试验确定高效液相色谱测定有机酸的最佳条件为:Agilent Eclipse XDB－C18色谱柱(4.6mm ×150mm，5μm);检测器为紫外检测器，检测波长为 210 nm;流动相为甲醇∶0.01 mol/L KH2PO4－H3PO4缓冲溶液(3∶97，pH 值为 2.85);流速为0.8 mL/min;柱温为25℃;进样量为20 μL.

2)此方法的操作可行性比较强、可以同时并快速的检测样品中的有机酸，不论是从精密度还是重复性，均可以确定.

3)因为豆腐黄浆水中的成分复杂，各种有机酸在豆腐黄浆水中的配比稍有差异，与有机酸标准品的各种酸配比也不可能完全相同，导致有些有机酸保留时间与标准样品的保留时间稍有不同.

［1］石彦国.大豆制品工艺学［M］.2版.北京:中国轻工业出版社，2005.

［2］宋莲军.乳酸菌发酵黄浆水制作豆腐凝固剂的方法［P］.中国专利:201010185982.8，2011－11－30.

［3］高卫卫，杜金华，于 玲，等.樱桃酒中有机酸种类和含量的研究［J］.食品与发酵工业，2008，34(10):145 －149.

［4］王玉君，李烈英，孙永乐，等.高效液相色谱法分析色酒中有机酸的研究［J］.色谱，1991，9(4):271 －272.

［5］胡欣欣，蒋立温，刘 嘉，等.黄浆水酸化过程中有机酸的变化研究［J］.农产品加工，2011(3):74.

［6］张 培，李 昕，刘 芸，等.HPLC法测定浆水中有机酸的含量［J］.食品与发酵工业，2013，39(3):185 －186.

［7］DEBLOT S，COOK D R，FORD CM.L－Tartaric acid synthesis from vitamin Cin higher plants［C］//Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America，2006，103(14):5608－5613.

［8］贾洪峰，贺稚非，李洪军，等.高效液相色谱法测定发酵辣椒中的有机酸［J］.食品科学，2008，29(3):374 －379.

［9］陈晓莉，李永吉，王录娜，等.HPLC法测定马钱子缓解片中士的宁与马钱子碱［J］.哈尔滨商业大学学报:自然科学版，2013，29(4):390 －393.