鸡冠花乙醇提取物的HPLC指纹图谱研究

张海晶，金 兰，于金平，陈大忠

(1.黑龙江中医药大学 中医药研究院，哈尔滨150040 2.东北农业大学食品学院，哈尔滨150030)

鸡冠花为苋科(Amaranthaceae)青葙属植物鸡冠花(Celosia cristata L.)的干燥花序［1］，该植物在世界各地分布广泛，资源丰富.其药用历史悠久，是我国一味传统的中药，在抗糖尿病［2］、抗阴道毛滴虫、止血、抗衰老及保肝等作用［3－7］等方面具有很好的药理活性.然而，对于该药材的质量控制的报道极少见，甚至没有.中药指纹图谱是运用现代分析技术对中药化学信息以图形的方式进行表征并加以描述，凭借其准确性和可操纵性已经成为国际公认的中药或天然药物质量标准控制的最有效手段之一.HPLC具有分离效率高、分析速度快、灵敏度高、稳定性和重现性好、流动相选择性广等特点，非常适合构建中药指纹图谱.HPLC指纹图谱是目前国际上认可的一种中药质量评价模式，可以通过把握中药指纹的特征，评价中药材的真实性、优良性和稳定性，是建立中药现代质量标准体系的核心技术.本文对鸡冠花的HPLC指纹图谱进行了探讨，并对其研究方法学进行考察，从而为该药材的质量控制提供一个更为可行的依据.

1 实验材料

Waters 2695高效液相色谱仪(Waters 2996二极管阵列检测器，Waters Empower Pro色谱工作站)，Dikma C18色谱柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);LA204电子分析天平(瑞士梅特勒－托利多仪器有限公司);KQ－2500E超声清洗机.乙腈、磷酸为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯;山奈酚对照品(MUST－10102801，中国食品药品检定研究院)、槲皮素对照品(100081－200406中国食品药品检定研究院)、木犀草素对照品(111520－200504，中国食品药品检定研究院).

鸡冠花分别收集于黑龙江、湖南、河北、吉林等地，共10批，经黑龙江中医药大学药学院生药学教研室孙慧峰教授鉴定为苋科青葙属植物鸡冠花(Celosia cristata L.).标本(20110912)保存于黑龙江中医药大学中医药研究院.

2 试验方法

2.1 色谱条件

色谱柱:Dikma C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，流动相:乙腈－0.1%磷酸水溶液梯度洗脱，流速:1.0 mL/min，柱温:25℃，检测波长:260 nm，分析时间:90 min，进样量:20 μL.

2.2 对照品溶液制备

分别精密称取山奈酚、槲皮素、木犀草素标准品适量，分别加甲醇充分溶解，定容于10 mL的容量瓶中，过0.45μm滤膜过滤后作为对照品溶液.

2.3 供试品溶液制备

将晒干的鸡冠花药材粉碎机粉碎后过60目筛，称取干燥粉末5.0 g，加入95%的乙醇50 mL，精密称定质量，超声提取60 min.放冷，再称定质量，并用溶剂补足减失的质量，摇匀，滤过，用甲醇定容于25 mL容量瓶中，溶液过0.45μm微孔滤膜，即得供试品溶液.

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验

取同一份供试品溶液，按上述色谱条件连续进样6次，分别记录各共有峰相对保留时间和相对峰面积.结果各共有峰相对保留时间RSD为0.02%～0.76%，RSD ＜1%，相对峰面积 RSD 为0.07%～1.38%，RSD＜3%，表明仪器性能良好，符合指纹图谱的要求.

2.4.2 稳定性试验

取同一份供试品溶液，按上述色谱条件分别于0、3、6、9、12、24 h 进样检测，记录各共有峰相对保留时间和相对峰面积.结果各共有峰相对保留时间RSD为0.02% ～0.39%，RSD＜1%，相对峰面积RSD为0.14% ～1.84%，RSD＜3%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好.

2.4.3 重现性试验

精密称取同一批样品6份，制备供试品溶液进行分析，方法同以上实验.结果各共有峰相对保留时间RSD为0.03% ～0.53%，RSD＜1%，相对峰面积RSD为0.41% ～2.24%，RSD＜3%，表明本方法具有较好的重现性结果，符合指纹图谱要求.

3 实验结果

3.1 鸡冠花指纹图谱的建立

分别将对照品溶液及10批鸡冠花供试品溶液各20μL注入高效液相色谱仪，按确定的上述色谱条件进行测定，并记录90 min内的色谱图.在10批样品的指纹图谱中，其相对保留时间及色谱峰较稳定的峰有16个，确定为鸡冠花共有峰，即1～16号峰.通过与对照品对照，指认了其中3个化合物色谱峰.即9号峰为木犀草素;10号峰为槲皮素;13号峰为山奈酚.具体见图1、2.

3.2 指纹图谱相似度评价

根据10批鸡冠花的HPLC图谱，并以1号药材谱图作为参照谱进行指纹匹配，S峰为内参比峰计算相对保留时间及峰面积.将所得的AIA格式色谱图依次导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》(研究版)软件，输出了10批鸡冠花指纹图谱及鸡冠花对照指纹图谱，并以此为基准，进行相似度计算，结果10批不同产地的鸡冠花药材的相似度均大于0.9.具体见图3.

图1 样品色谱图与标准品色谱图比较

图2 鸡冠花指纹图谱共有模式图

图3 不同产区鸡冠花HPLC指纹图谱

4 讨论

4.1 检测波长的选择

利用Waters 2695－2996高效液相色谱仪，进行全波长扫描，本着色谱信息丰富、出峰的数目适中且各峰之间分离度好的原则，确定260 nm为其检测波长.

4.2 流动相的确定

本实验分别考察了甲醇－水、乙腈－水、甲醇－0.1%磷酸水溶液、乙腈－0.1%磷酸水溶液4种系统，并分别以不同的梯度进行洗脱，记录色谱图.结果表明，乙腈－0.1%磷酸水溶液进行梯度洗脱，色谱峰信息较多，分离效果好，且基线平稳.乙腈(A)－0.1%磷酸水溶液(B)梯度洗脱:0～15 min，5% ～20%A;15～35 min，20% ～30%A;35～45 min，30% ～40%A;45 ～60 min，40% ～65%A;60～70 min，65% ～85%A;70 ～90 min，85% ～100%A.

4.3 提取溶剂的考察

本实验选择了5种溶剂超生提取进行比较，包括50%甲醇、100%甲醇、水、65%乙醇、95%乙醇.结果表明，不同的溶剂提取所得到的色谱图的差别较大，水提得到的色谱图峰数较少，50%甲醇和65%乙醇提取得到的色谱图基本类似，100%甲醇和95%乙醇提取得到的色谱图基本类似，但是95%乙醇提取得到的色谱图的峰分离较好，并且基线较平稳，故选择95%乙醇作为提取溶剂.

5 结语

本实验采用高效液相色谱法对不同产地鸡冠花进行指纹图谱研究，以多种化学成分的保留时间和峰面积为参数进行整体考察并计算其相似度，建立了不同产区鸡冠花的指纹图谱并生成鸡冠花特征指纹图谱.通过《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2004A版)软件对10批不同产地鸡冠花指纹图谱比较分析，确定10批样品有16个特征指纹峰，各共有峰的相对保留时间稳定，但相对峰面积不同，表示不同产地所含的化学成分种类相似，但各成分的含量有所差异.10批鸡冠花样品与共有模式的相似度均大于0.9，表明本实验所建立的指纹图谱特征性较强、稳定性较好，可为鸡冠花药材的质量控制提供科学的依据和有效的鉴别方法.

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