丁彩真,于曙光,王艳丽,金玉波,郑国生
(1.青岛农业大学化学与药学院,山东 青岛266109;2.即墨市第二中学,山东 即墨266214;3.青岛农业大学生命科学学院,山东 青岛266109)
丹皮,又名牡丹皮,为毛茛科植物牡丹的干燥根皮,具有清热凉血、活血散瘀的功效,用于治疗血滞经闭、痛经、痈肿疮毒、跌扑伤痛、温毒发斑等症[1]。现代药理学研究表明,丹皮具有保护心血管系统、抗菌、消炎等作用[2]。丹皮中含有牡丹酚(paeonol)、牡丹酚甙(paeonoside)、牡丹酚原甙(paeonolide)、牡丹酚新甙(apiopaeonoside)、芍药甙(paeoniflorin)、氧化芍药甙(oxypaeoniflorin)、苯甲酰芍药甙(benzoyl-paeoniflorin)、苯甲酰氧化芍药甙(benzoyl-oxypaeoniflorin)、没食子酸(gallic acid)、挥发油、植物甾醇、蔗糖、黄酮类化合物等[3-4]。近年来,人们对丹皮的研究主要集中于丹皮酚及其衍生物的生物活性[5-7],而对丹皮中含有的生物类黄酮研究较少。研究表明,生物体内的黄酮类化合物具有较强的生物活性[8-11],如抗氧化、抗肿瘤、抗HIV等,同时对心脑血管疾病具有明显的改善作用。丹皮中生物类黄酮的研究和开发也日益得到人们的重视[12]。
作者以丹皮为原料提取丹皮总黄酮并测定其含量,以常用的抗氧化剂 2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)和叔丁基对苯二酚(TBHQ)为对照,采用4种方法评价丹皮总黄酮的抗氧化活性,以期从丹皮中提取得到高效抗氧化的生物类黄酮,为资源丰富的牡丹在医药、食品等领域的综合开发利用开辟新的途径。
2013年10~11月份采挖青岛农业大学牡丹种植基地3~5年生凤丹的壮硕根部,剥取根皮,晒干。
石油醚、乙醇、乙醚、丙酮、硫酸、苯酚、硫酸钠、硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠、葡萄糖、三氯乙酸、硫代巴比妥酸(TBA)、邻苯三酚、盐酸、H2O2、FeSO4、BHT、二苯代苦味肼基自由基(·DPPH)、芦丁、TBHQ,均为分析纯。
参照刘昌平[13]提取金银花中总黄酮的方法:取一定量丹皮,以乙醚为抽提剂,用索氏提取法脱脂并除去脂溶性色素;挥干乙醚,用75%乙醇回流提取得到丹皮总黄酮粗提物;浓缩,干燥,得到粉末即丹皮总黄酮样品。
以30%乙醇为溶剂配制系列芦丁标准品溶液,绘制标准曲线,得到拟合回归方程为c=0.0105A-0.0116,R2=0.9989。然后以丹皮总黄酮样品20.0 mg取代芦丁,测定丹皮总黄酮样液的吸光度。按回归方程计算样品中丹皮总黄酮含量,并计算其在丹皮中的含量。
分别测试不同浓度的丹皮总黄酮样液对·DPPH、羟基自由基(·OH)、超氧阴离子自由基的清除率以及对小鼠肝组织脂质过氧化的抑制率,以相同浓度的抗氧化剂(BHT和TBHQ)为对照,综合评价丹皮总黄酮的体外抗氧化活性。
1.3.1 对·OH清除率的测定
采用Fenton反应(亚铁离子催化过氧化氢产生·OH)[14-15],在λ=536nm处测定反应混合物的吸光度(用蒸馏水调零),按式(1)计算丹皮总黄酮对·OH清除率(D1):
式中:AP为1.0mL蒸馏水的空白吸光度;As为1.0mL的丹皮总黄酮样液的吸光度;Ab为用1.0mL 30%乙醇代替1.0mL过氧化氢时测得的吸光度。
参照范秀萍等[16]的方法,在λ=299nm处测定反应混合物的吸光度(用蒸馏水调零),按式(2)计算丹皮总黄酮对·O-2清除率(D2):
式中:A0为0.1mL蒸馏水的空白吸光度;A1为0.1mL丹皮总黄酮样液的吸光度。
1.3.3 对·DPPH清除率的测定
参照彭长连等[17]的方法,在λ=517nm处测定吸光度,按式(3)计算丹皮总黄酮对·DPPH清除率(D3):
式中:A0为2.0mL乙醇的空白吸光度;A1为2.0mL丹皮总黄酮试液的吸光度(需要用2.0mL乙醇与2.0mL样液混匀后调零,以排除样液本身颜色的影响)。
1.3.4 对小鼠肝组织脂质过氧化抑制率的测定
参照郑晶泉[18]的方法(TBA 法),在λ=532nm处测其吸光度,按式(4)计算丹皮总黄酮对脂质过氧化抑制率(D4):
式中:A0为0.2mL蒸馏水的空白吸光度;A1为0.2mL丹皮总黄酮样液的吸光度(需要用蒸馏水代替TBA混匀后调零)。
1.3.5 半抑制浓度(IC50)的测定
参照徐清萍等[19]的方法计算各抗氧化测试反应的半抑制浓度(IC50)。
丹皮总黄酮样品中总黄酮含量为56.72%,在丹皮中的含量为1.6304%。
2.2.1 丹皮总黄酮对自由基的清除率及对脂质过氧化的抑制率
不同浓度的丹皮总黄酮以及BHT和TBHQ对自由基·OH、、·DPPH的清除率以及对脂质过氧化的抑制率见表1 。
表1 不同浓度下,丹皮总黄酮、BHT和TBHQ对自由基的清除率及对脂质过氧化的抑制率Tab.1 The scavenging rate of radicals and inhibition rate of lipid peroxidation of the total flavonoids fromTree peony bark,BHT and TBHQ at different concentrations
比较相同浓度的丹皮总黄酮、BHT和TBHQ对不同自由基清除率及对脂质过氧化抑制率发现,三者均符合对·OH清除率>对·DPPH清除率>对·O-2清除率>对小鼠肝组织脂质过氧化抑制率的规律。说明3种抗氧化物质可能具有类似的抗氧化机制,推测它们可能具有类似的结构。
比较相同浓度的丹皮总黄酮、BHT和TBHQ对相同自由基清除率及脂质过氧化抑制率发现,基本上符合TBHQ≥丹皮总黄酮>BHT的规律。BHT是目前国内外广泛使用的油溶性抗氧化剂,TBHQ是在美国、日本已广泛使用的效果较好的抗氧化剂,丹皮总黄酮的抗氧化活性略低于或等于TBHQ的抗氧化活性,且远远大于BHT的抗氧化活性,在较低浓度下即具有较好的氧化反应抑制作用。
2.2.2 半抑制浓度
在同一体系中,半抑制浓度IC50越小,表明样品清除自由基的能力越强。丹皮总黄酮、BHT和TBHQ对不同氧化反应的半抑制浓度如表2 所示。
表2 丹皮总黄酮、BHT和TBHQ对4种氧化反应的半抑制浓度Tab.2 The IC50value of the total flavonoids fromTree pe ony bark,BHT and TBHQ to four oxidation reactions
从表2 可看出,同种物质对于不同氧化反应的抑制效果、以及不同物质对于同种氧化反应的抑制效果的规律与2.2.1相同。
以常用的化学抗氧化剂BHT和TBHQ为对照,测试了丹皮总黄酮对·OH、、·DPPH的清除能力以及对小鼠肝组织脂质过氧化的抑制作用,并以此来评价丹皮总黄酮的体外抗氧化能力。结果表明,丹皮总黄酮对·OH清除率>对·DPPH清除率>对清除率>对小鼠肝组织脂质过氧化抑制率;丹皮总黄酮具有较强的抗氧化能力;其抗氧化活性略低于或等于TBHQ的抗氧化活性,且远远大于BHT的抗氧化活性,在较低浓度下即对多种氧化反应具有抑制作用。表明,丹皮总黄酮是一种很有发展前景的天然抗氧化剂。
[1]国家药典委员会.中国药典(一部)[M].2000年版.北京:化学工业出版社,2000:137.
[2]李方军.牡丹皮化学成分及药理作用研究进展[J].安徽医药,2004,8(1):9-10.
[3]YOSHIKAWA M,OHTA T,KAWAGUCHI A,et al.Bioactive constituents of Chinese natural medicines.V.Radical scavenging effect of Moutan Cortex.(l):Absolute stereostructures of two monoterpenes,paeonisuffrone and paeonisuffral[J].Chem Pharm Bull(Tokyo),2000,48(9):1327-1331.
[4]严永清.中药辞海(第2卷)[M].北京:中国医药科技出版社,1996:282-285.
[5]许同桃,高健,许兴友,等.丹皮酚及其衍生物的研究进展[J].中国药业,2008,17(3):3-5.
[6]巩丽萍,王少云,徐长卿.丹皮酚的研究进展[J].食品与药品,2005,(7):14-17.
[7]吴晓慧,吴国荣,张卫明,等.丹皮酚提取、磺化及对植物病原菌的抑菌试验[J].中药材,2003,26(11):780-781.
[8]潘英明.槐米花抗氧化成分的提取及其活性研究[J].林产化学与工业,2007,27(2):41-44.
[9]MIDDLETON E,KANDASWAMI C.Potential health promoting.Properties of citrus flavonoids[J].Food Technol,1994,48:115-119.
[10]NG T B,LIU F,WANG Z T.Anti-oxidative activity of natural products from plants[J].Life Science,2000,66(8):709-723.
[11]文良娟,刘苇芬.苦瓜黄酮的提取条件及其抗氧化活性研究[J].食品科学,2007,28(9):183-186.
[12]张甘良,汪钊,鄢洪德.生物类黄酮化合物的结构与生物活性的关系[J].生物学杂志,2005,22(1):4-7.
[13]刘昌平.金银花黄酮的抗氧化活性分析[J].安徽农业科学,2009,37(20):9483-9484.
[14]熊双丽,李安林,金征宇.猪喉软骨硫酸软骨素体外超氧阴离子自由基清除机理探讨[J].食品科学,2008,29(2):362-365.
[15]杨保收,陈越,金久善,等.氧自由基检测方法在生物学和医学中的应用[J].动物科学与动物医学,1999,16(7):17-18.
[16]范秀萍,吴红棉,王娅楠,等.4种贝类糖胺聚糖体外清除自由基活性的比较[J].食品科技,2008,33(2):165-167.
[17]彭长连,陈少薇,林植芳,等.用有机自由基 ·DPPH法评价植物抗氧化能力[J].生物化学与生物物理进展,2000,27(6):658-661.
[18]郑晶泉.抗氧化剂抗氧化实验研究进展[J].国外医学:卫生学分册,2000,27(1):37-40.
[19]徐清萍,敖宗华,陶文沂.恒顺香醋·DPPH自由基清除活性成分的研究[J].中国调味品,2004,(7):19-23.