吴茱萸碱的体外抗肿瘤活性研究

刘东梅，杨云云，杜俊潮，杨红艳，郭 惠，王昌利，马晓军

（陕西中医学院药学院，陕西 咸阳712046）

吴茱萸为芸香科植物吴茱萸的干燥近成熟果实。始载于《神农本草经》，味苦辛、性温热、有小毒，具有散寒止痛、降逆止吐、助阳止泻之功效[1］。吴茱萸的主要活性成分为生物碱，其中吴茱萸碱（分子结构见图1）被认为是吴茱萸生物碱的主要药效成分之一，具有抗肿瘤、降压、调节体温、镇痛、抗菌、抗炎、抗过敏等作用[2－4］。关于吴茱萸碱的抗肿瘤活性，近年来国内外已有一些报道[5－8］。MTT法是目前美国国立肿瘤研究所推行的抗癌药物体外筛选法，用于测定活细胞及细胞增殖[9］。作者前期研究了吴茱萸碱的体内抗肿瘤活性[7］，为了进一步研究它的体外抗肿瘤活性，采用MTT法在不同的时间点检测了不同浓度的吴茱萸碱对S180、H22、HepG2肿瘤细胞的抑制情况。

图1 吴茱萸碱的结构式Fig.1 The structural formula of evodiamine

1 实验

1.1 实验细胞株和培养基

小鼠S180腹水肉瘤细胞、小鼠H22腹水型肝癌细胞、人源HepG2肝癌细胞和人血管内皮细胞ECV304，由第四军医大学实验动物中心提供。

完全培养基：RPMI1640培养基（Gibco公司）85%，胎牛血清（Hyclone）10%，双抗5%。

1.2 药物及试剂

吴茱萸碱为合成所得[10］；四甲基偶氮唑盐（MTT），Amresco公司；二甲基亚砜（分析纯），镇江市化学试剂厂；顺铂粉剂（cisplatin，DDP），规格：每支20 mg，山东齐鲁制药有限公司。

1.3 MTT比色法[11－12］

取对数生长期细胞，制备成浓度为2×105个·mL－1的细胞悬液。接种于96孔培养板，每孔180 μL。24h后，每孔中加入20μL不同浓度（640μg·mL－1、320μg·mL－1、160μg·mL－1、80μg·mL－1、40μg·mL－1）吴茱萸碱溶液，使药物的最终浓度为64 μg·mL－1、32μg·mL－1、16μg·mL－1、8μg·mL－1、4μg·mL－1。同时设空白组（不加药物和细胞，其它与用药组相同）、阳性对照组（顺铂DDP，终浓度4μg·mL－1）、对照组（加入细胞，不加药物），每组设4个复孔培养。于37℃、5%CO2培养箱中分别培养24h、48h、72h后，每孔加入20μL MTT，培养4h。贴壁细胞直接吸取出孔中上清液后加入150μL DMSO（悬浮细胞将细胞移至EP管中，离心弃上清，加入150μL DMSO），振荡10min后用酶标仪在492 nm处检测OD值。所有实验在相同条件下重复3次，按下式计算细胞抑制率：

1.4 统计学分析

实验结果以（珚x±s），采用Two－way ANOVA方差分析进行两组及多组样本均数的比较，所得数据由graphpad prism5统计软件进行统计学分析。

2 结果与讨论

2.1 吴茱萸碱对S180肉瘤细胞的抑制率（表1 ）

表1 不同浓度的吴茱萸碱在不同的时间点对S180肉瘤细胞的抑制率（珔x±s）Tab.1 The inhibition rate of evodiamine at different concentrations in 24h，48h，72hto S180cell lines

由表1 可知，吴茱萸碱在不同的作用时间对S180肉瘤细胞均呈现一定的剂量依赖性，随着浓度的增大，抑制率逐渐提高。在浓度为4μg·mL－1、8μg·mL－1时，吴茱萸碱对S180肉瘤细胞作用24h、48h、72h后，抑制率分别为14.18%、16.24%、19.37%和24.63%、24.77%、38.05%，其抑制率随着时间的延长而持续提高，说明在较低浓度下吴茱萸碱对S180肉瘤细胞的抑制率与时间呈正相关；当浓度大于16μg·mL－1时，作用48h和72h，抑制率相差不大，说明在48h时已经达到了稳定抑制率，继续延长作用时间，抑制率没有明显提高。因此，吴茱萸碱对S180肉瘤细胞而言，属于浓度依赖型药物[12］。吴茱萸碱与对照组比较，作用极其显著，具有统计学意义。与经典的抗癌药物顺铂比较，高浓度的吴茱萸碱对S180肉瘤细胞的抑制率比4μg·mL－1的顺铂高。

2.2 吴茱萸碱对H22肝癌细胞的抑制率（表2 ）

表2 不同浓度的吴茱萸碱在不同的时间点对H22肝癌细胞的抑制率（珔x±s）Tab.2 The inhibition rate of evodiamine at different concentrations in 24h，48h，72hto H22cell lines

由表2 可知，吴茱萸碱在不同的作用时间对H22肝癌细胞均呈现剂量依赖性，随着浓度的增大，抑制率逐渐提高。但吴茱萸碱没有时间相关性，各浓度在24h时即达到较为稳定的抑制率，延长作用时间，抑制率无明显变化。吴茱萸碱与对照组比较，作用极其显著，具有统计学意义。与经典的抗癌药物顺铂比较，在浓度为4μg·mL－1，作用24h、48h时，吴茱萸碱与4μg·mL－1的顺铂对 H22肝癌细胞的抑制作用相当；但作用72h时，4μg·mL－1的顺铂对H22肝癌细胞的抑制作用比同浓度的吴茱萸碱稍高，高浓度的吴茱萸碱对H22肝癌细胞的抑制率比4μg·mL－1的顺铂高。

2.3 吴茱萸碱对HepG2肝癌细胞的抑制率（表3 ）

由表3 可知，吴茱萸碱对HepG2肝癌细胞既呈现一定的剂量依赖性，又呈现时间依耐性。随浓度增大和时间延长，抑制率逐渐提高。吴茱萸碱与对照组比较，作用极其显著，具有统计学意义。与经典的抗癌药物顺铂比较，浓度为4μg·mL－1的吴茱萸碱作用24h、48h时，对 HepG2肝癌细胞的抑制作用比4μg·mL－1的顺铂稍差，但高浓度时，吴茱萸碱对HepG2肝癌细胞的抑制率比4μg·mL－1的顺铂高。作用72h时，浓度为32μg·mL－1、64μg·mL－1的吴茱萸碱对HepG2肝癌细胞的抑制率比4μg·mL－1的顺铂高，其它浓度的吴茱萸碱都比4μg·mL－1的顺铂的抑制率低。

表3 不同浓度的吴茱萸碱在不同的时间点对HepG2肝癌细胞的抑制率（珔x±s）Tab.3 The inhibition rate of evodiamine at different concentrations in 24h，48h，72hto HepG2cell lines

2.4 吴茱萸碱对ECV304细胞的抑制作用

为了进一步考察吴茱萸碱对正常细胞的毒副作用，研究了不同浓度（64μg·mL－1、32μg·mL－1、16 μg·mL－1、8μg·mL－1、4μg·mL－1）的吴茱萸碱在24h对人血管内皮细胞ECV304的抑制作用，结果见表4。

表4 24h下不同浓度吴茱萸碱对ECV304细胞的抑制作用Tab.4 The inhibition effects of evodiamine at different concentrations in 24hto ECV304cell lines

由表4可知，不同浓度的吴茱萸碱对ECV304细胞作用24h后，有一定的伤害作用，且浓度越高伤害越大，有统计学意义（P＜0.05），半数抑制质量浓度IC50为124.65μg·mL－1。

2.5 吴茱萸碱的半数抑制质量浓度IC50

通过回归曲线可测得吴茱萸碱对S180、H22、HepG2细胞的半数抑制质量浓度，结果见表5 。

表5 吴茱萸碱对三种肿瘤细胞的半数抑制质量浓度（IC50）Tab.5 The IC50values of evodiamine to 3types of tumor cell lines

由表5 可知，吴茱萸碱作用24h时，对H22肝癌细胞的抑制作用相对较好，IC50值最小（17.49μg·mL－1）；作用48h时，对S180肉瘤细胞的抑制作用相对较好，IC50值最小（17.54μg·mL－1）；作用72h时，对HepG2肝癌细胞的抑制作用相对较好，IC50值最小（13.26μg·mL－1）。对同一种细胞不同时间点的IC50值进行比较发现，吴茱萸碱作用于S180肉瘤细胞72h时抑制作用最强；对 H22肝癌细胞，24h时抑制作用最强；对 HepG2肝癌细胞，72h时抑制作用最强。同时从IC50值也可以看出，吴茱萸碱对正常的人血管内皮细胞ECV304也有一定的伤害作用；作用24 h后，IC50值为124.65μg·mL－1。提示吴茱萸碱有一定的细胞毒作用。

3 结论

采用MTT法在不同的时间点检测了不同浓度的吴茱萸碱对S180肉瘤细胞、H22肝癌细胞、人源HepG2肝癌细胞的抑制作用。结果表明，吴茱萸碱在一定浓度下对三种肿瘤细胞有明显的抑制作用，且随药物浓度的增大，抑制率逐渐增大，与正常组比较作用极其显著。吴茱萸碱作用24h时，对H22肝癌细胞的生长抑制作用较好，IC50值最小（17.49μg·mL－1）；作用48h时，对S180肉瘤细胞的抑制作用相对较好，IC50值 最 小 （17.54μg·mL－1）；作 用 72h 时，对HepG2肝癌细胞的抑制作用最好，IC50值最小（13.26 μg·mL－1）。

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