一管式多引物焦磷酸测序技术在HPV分型检测中的应用

钟 丹，薛 群，王淑一（杭州艾迪康医学检验中心，杭州 310023）

人类乳头瘤病毒（HPV）是一群微小的、无包膜的双链DNA病毒，其DNA长约8kb。目前发现的HPV基因型已经超过了100种［1］。根据不同基因型HPV致瘤能力的高低，一般将其分为高危型、潜在高危型和低危型3类［2－3］。基础研究和流行病学调查研究证据都表明，HPV特别是高危型HPV的感染是几乎导致子宫颈癌的必要条件［4］。本研究采用焦磷酸测序技术，在1个标本模板孔中使用多个测序引物，同时对7种 HPV亚型，即 HPV－6、11、16、18、31、33、45基因进行扩增检测，以期为一管式多引物焦磷酸测序技术在HPV分型检测中的应用提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 志愿参加本次研究的女性患者517例，均签署知情同意书，年龄19～51岁。

1.2 方法

1.2.1 标本的采集和预处理 用刮板或生理盐水浸润的棉棒从阴道和宫颈外口取分泌物和细胞；在进行涂片标本细胞学检查的同时，将标本放入5mL含有0.05%硫柳汞的磷酸盐缓冲液（PBS）中，离心（3 000×g、10min）洗涤2次，沉积细胞重悬于1mL PBS中，取0.5mL细胞悬液抽提DNA。

1.2.2 标本核酸的提取 按1体积细胞悬液加入10倍体积的细胞裂解液［10mmol／L盐酸三羟甲基氨基甲烷（Tris－HCl），pH7.4，10mmol／L乙二胺四乙酸（EDTA），150mmol／L氯化钠（NaCl），0.4%十二烷基磺酸钠（SDS），1.0mg／mL蛋白酶K］，37℃温育过夜；以等体积酚／氯仿（1∶1），氯仿／异戊醇（24∶1）各抽提2次；加入1／10倍体积的3mol／L、pH5.2乙酸钠（NaAc）及2.5倍体积无水乙醇，－20℃放置2h或过夜以沉淀DNA；加入1倍体积乙醇洗涤1次；用60μL含RNA酶（100μg／mL）的 TE 溶 液 （10mmol／L Tris－HCl，pH 8.0，1.0mmol／L EDTA）溶解 DNA，37℃温育30min。

1.2.3 聚合酶链反应（PCR）扩增 （1）半巢式 PCR 扩增HPV通用型引物：MY09引物序列为5′－CGT CCM ARR GGA WAC TGA TC－3′，MY11 引 物 序 列 为 5′－GCM CAG GGW CAT AAY AAT GG－3′，其中，M 为 A 或 C、R为 A 或G、W 为 A或T、Y为C或 T；GP6＋引物序列为5′－biotin－GAA AAA ATA AAC TGT AAA TCA TAT TC－3′。（2）PCR 扩增：反应体系为20μL，包括1×PCR缓冲液、0.4mmol／L dNTP、0.2μmol／L引物、KODFX PCR扩增酶0.02U／μL、模板2μL；反应条件为95℃3min、95℃10s、54℃30s、72℃30s循环10次，95℃10s、40℃30s、72℃30s循环30次，72℃5min。（3）对照设置：每次试验均设阳性及阴性对照，以载有6型HPV基因组序列的重组质粒（每个反应为100pg）为阳性对照，以无HPV基因组序列的人细胞DNA为阴性对照。（4）凝胶电泳：对扩增后的产物进行琼脂糖凝胶电泳，并在紫外线下观察和拍照。

1.2.4 焦磷酸测序 （1）应用 QIAGEN PyroMark Q96ID型焦磷酸测序仪配套的单链纯化装置从PCR反应体系中分离出单链DNA；（2）在QIAGEN PyroMark Q96ID型焦磷酸测序仪测序板的每个反应孔中分装45μL测序反应液，将分离好的单链DNA转入测序板孔，测序板80℃温浴2min后转至室温冷却；（3）将测序板放入测序仪中，新建1个SQA程序，根据测序仪程序自动计算出的试剂量在试剂仓中加入相应体积的试剂，包括酶类、底物荧光素、dATP、dCTP、dGTP、dTTP，运行程序。

1.2.5 PCR－反向点杂交法 采用PCR体外扩增和DNA反向点杂交相结合的DNA芯片技术。利用HPV的基因特点设计特异引物，对23种HPV基因型的目标片段进行扩增，再将PCR扩增产物与固定在膜条上的包括18种高危型和5种低危型在内的分型探针进行杂交，依据杂交信号的有无来判断HPV感染情况并加以分型。

1.2.6 结果读取及分析 根据GenBank网站上针对不同HPV型别所设计的引物继而进行测序所得到的序列（表1），通过焦磷酸测序结果图读取HPV基因扩增阳性标本中的HPV型别。

表1 焦磷酸测序HPV分型结果

2 结 果

2.1 半巢式PCR扩增片段的电泳鉴定 517例标本中有218例可成功扩增出明显的190bp的目的条带，部分标本PCR扩增产物电泳结果见图1。

图1 半巢式PCR扩增产物凝胶电泳图

2.2 焦磷酸HPV分型结果 将扩增出目的条带的半巢式PCR扩增产物进行焦磷酸测序分析，采用多引物测序法，根据表1焦磷酸测序读取序列，通过分析焦磷酸测序结果图读取HPV型别。采用多引物测序法测序得到的焦磷酸测序结果图见图2。根据HPV分型读取序列比对，可对标本中的HPV进行分型。218例PCR扩增阳性标本中，可判断为HPV－6、11、16、18、31、33、45的标本有 62例，其中 HPV－6占 12.9%，HPV－11占11.29%，HPV－16占37.1%，HPV－18占12.9%，HPV－31占6.45%，HPV－33占9.68%，HPV－45占 6.45%。不同型别HPV多重感染标本焦磷酸测序结果图见图3。共检出HPV－16、18多重感染标本及HPV－18、45多重感染各1例，检出率均为1.6%。

图2 多引物测序法焦磷酸测序图

2.3 焦磷酸HPV分型与PCR－反向点杂交法检测一致性分析 本研究中7种HPV型别测序阳性标本再次通过PCR－反向点杂交法检测，结果两种方法7中HPV型别的判断结果均相符，两种方法检测结果具有良好的一致性。

3 讨 论

基因测序是分子诊断领域中应用最为广泛的技术之一。传统的基因测序方法是Sanger终止法，该方法一次只能读取单个基因的序列，因此，对于有众多基因亚型的病原体感染性疾病，很难获得理想的测序结果［5］。焦磷酸测序技术是近年来发展起来的一种新的序列分析技术，其分析原理是：核苷酸和模板结合后释放的焦磷酸引发酶的级联反应，促使荧光素发光，通过检测发光信号而获得测序结果。焦磷酸测序技术最大优点是可以实现高通量、高效率，最为重要的是，可同时检测多至5种以上病原体基因亚型，对于当前日益增多的混合型HPV感染无疑具有广阔的临床应用前景［6］。

本研究采用一管式多引物测序法，根据临床相关性和流行性，设计了7个测序引物在同一反应孔中进行测序，可同时检测的病原体包括高危型 HPV－16、18、31、33，以及与肿瘤形成相关的HPV－45。据统计，全球范围内80%的宫颈癌患者都存在上述 HPV亚型单独或混合感染［2，7］。此外，低危型 HPV－6和HPV－11则在生殖器疣的发病机制中具有重要作用。本研究结果证明，与采用通用引物进行测序的传统方法相比，一管式多引物测序法在引物设计方面有助于更有效地针对不同亚型的特异性区域，所采用的焦磷酸测序技术则能够准确、快速地分型，从而降低成本，缩短检测时间。而且，另有研究发现该方法不仅能够检测混合型感染标本，还能确定不同型别病原体所占的比例［8］。

杂交法的临床应用已得到普及，但临床实践中存在一定的假阴性和假阳性结果，且不能排除发生交叉污染的可能性［9］。本研究采用焦磷酸测序技术检出218例HPV感染标本，并对病原体进行了分型，与杂交法检测结果比较，二者检测结果的符合率是100%。焦磷酸测序法一次性检测标本数远远大于其他方法，并能够同时检测混合型感染，操作方便，并且能够较为直观、准确地读取测序结果。已证实HPV感染是肿瘤、宫颈上皮内瘤变和疣的主要致病因素，HPV检测在上述疾病常规初筛中的应用价值较高，已在临床中广泛应用，而且，由于不同的HPV型别具有不同的致病性，所以研究HPV检测方法十分重要［2］。本研究对PCR扩增后的片段进行多引物测序序列分析，不仅可以检测具体型别，还可以对混合型感染中的HPV型别进行鉴别，具有广泛的临床应用前景。

［1］Burd EM.Human papillomavirus and cervical cancer［J］.Clin Microbiol Rev，2003，16（1）：1－17.

［2］Munoz N，Bosch FX，de Sanjose S，et al.Epidemiologic classification of human papillomavirus types associated with cervical cancer［J］.N Engl J Med，2003，348（6）：518－527.

［3］Herrero R，Castle PE，Schiffman M，et al.Epidemiologic profile of type－specific human papillomavirus infectionand cervical neoplasia in Guanacaste，Costa Rica［J］.J Infect Dis，2005，191（11）：1796－1807.

［4］Ciszek B，Heimrath J，Ciszek M.The application of human papilloma virus genotyping for the identification of neoplasm lesions in the cervix of women with abnormal cytology smears［J］.Adv Clin Exp Med，2012，21（6）：759－766.

［5］Tsiatis AC，Norris－Kirby A，Rich RG，et al.Comparison of Sanger sequencing，pyrosequencing，and melting curve analysis for the detection of KRAS mutations：diagnostic and clinical implications［J］.J Mol Diagn，2010，12（4）：425－432.

［6］Gharizadeh B，Kalantari M，Garcia CA，et al.Typing of human papillomavirus by pyrosequencing［J］.Lab Invest，2001，81（5）：673－679.

［7］Bosch FX，Manos MM，Munoz N，et al.Prevalence of human papillomavirus in cervical cancer：a worldwide perspective.International biological study on cervical cancer（IBSCC）Study Group［J］.J Natl Cancer Inst，1995，87（11）：796－802.

［8］Gharizadeh B，Oggionni M，Zheng B，et al.Type－specific multiple sequencing primers：a novel strategy for reliable and rapid genotyping of human papillomaviruses by pyrosequencing technology［J］.J Mol Diagn，2005，7（2）：198－205.

［9］Tan JH，Garland SM，Tabrizi SN，et al.Hybrid capture II testing for high－risk human papillomavirus DNA in the follow－up of women treated for high－grade cervical intraepithelial neoplasia［J］.Low Genit Tract Dis，2013，17（3）：308－314.