腺苷预处理对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织中内源性神经干细胞增殖的影响*

陈 娟，李 娟，谭 军

1)河南省荣军医院心脑血管科 新乡 453000 2)新乡市第一人民医院神经内科 新乡 453000 3)新乡医学院第三附属医院神经内科 新乡 453003

肌苷是腺苷的代谢产物，有研究[1-2]表明肌苷作为促进神经细胞轴突再生的小分子物质，参与神经细胞的自修复过程。腺苷在脑缺血再灌注损伤中的作用是脑缺血疾病相关基础研究的热点[3-5]。大鼠右侧大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型是基础研究中常用的局灶性脑缺血模型。该研究以MCAO模型大鼠为研究对象，通过对比分析正常大鼠、单纯MCAO模型大鼠、腺苷预处理后的MCAO模型大鼠的神经功能缺损评分、巢蛋白(Nestin)及Wnt1蛋白的表达情况，探讨腺苷对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护机制，为临床应用腺苷治疗脑缺血疾病提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物和主要试剂 清洁级成年健康雄性SD大鼠36只，体重200～250 g，购自新乡医学院实验动物中心。腺苷购自美国Amresco公司，兔抗大鼠Nestin、Wnt1多克隆抗体、SP-0023免疫组化试剂盒购自北京博奥森公司。

1.2 实验分组 用随机数字表法将36只大鼠分为假手术组、模型组和腺苷预处理组，每组12只。参考文献[6]制作大鼠MCAO模型，术后2 h将线栓向外拔出1 cm行再灌注。假手术组大鼠不结扎和插线，其余手术操作同模型组。腺苷预处理组大鼠在造模前3 d经腹腔注射腺苷1.5 mg/kg(溶于2 mL生理盐水中)，1次/d。假手术组和模型组大鼠在相同时间腹腔注射等体积生理盐水。

1.3 各组大鼠神经功能缺损评分 缺血再灌注7 d后采用5分制法[6]对各组大鼠进行神经功能缺损评分。

1.4 各组大鼠脑组织中Nestin蛋白表达的免疫组化检测 神经功能缺损评分完成后，用100 g/L的水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，断头开颅取脑组织，制成20 μm厚冰冻切片，PBS浸洗，微波抗原修复(96℃，15 min)，于体积分数为3%的去离子H2O2中37℃孵育10 min，PBS浸洗，山羊血清室温孵育15 min，加兔抗大鼠Nestin多克隆抗体(按1∶200稀释)，4℃过夜;阴性对照一抗用PBS替代;用SP试剂盒进行Nestin免疫组化检测，DAB显色，脱水、透明、封片。光学显微镜下(×200)观察，以细胞质内有棕黄色颗粒为Nestin阳性细胞，每张切片选择5个视野，每视野计数100个细胞计算阳性细胞百分率。

1.5 各组大鼠脑组织中Wnt1蛋白表达的Western blot检测 取脑组织，冰上分离右侧海马，加入裂解液，冰上裂解、匀浆，4℃低温离心机15000 r/min离心30 min，取上清。以SDS-PAGE分离，电转移蛋白至聚偏氟乙烯膜上，用50 g/L脱脂牛奶封闭2 h，然后弃去封闭液，加入一抗，封闭袋中4℃过夜，弃去一抗，用TBS洗10 min×3次。弃去TBS，加入二抗，37℃孵育1 h;弃去二抗，用TBS洗10 min×3次。增强化学发光显影，用凝胶成像分析仪采集图像，用Image图像处理软件进行吸光度分析。

1.6 统计学处理 采用SPSS 17.0进行分析，各组数据符合正态分布且方差齐，应用单因素方差分析和SNK-q检验比较各组大鼠神经功能缺损评分、脑组织中Nestin阳性细胞百分率及海马区脑组织中Wnt1蛋白表达的差异。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 各组大鼠神经功能缺损评分及脑组织中Nestin阳性细胞百分率的比较 见图1和表1。假手术组大鼠均无神经功能缺损症状，模型组和腺苷预处理组大鼠均有不同程度的神经功能缺损症状;腺苷预处理组大鼠神经功能缺损评分低于模型组。腺苷预处理组和模型组大鼠脑组织中Nestin阳性细胞百分率高于假手术组，腺苷预处理组高于模型组。

2.2 各组大鼠脑组织中Wnt1蛋白表达的比较见表1。

图1 各组大鼠脑组织中Nestin阳性细胞的表达(SP，×200)

表1 3组大鼠神经功能缺损评分及脑组织中Nestin阳性细胞百分率比较

3 讨论

Nestin是一种仅在胚胎发育早期神经上皮表达的中间丝蛋白，Nestin阳性表达的细胞可看作是神经干细胞(neural stem cell，NSC)[7]。研究[8-9]显示，脑缺血后3～7 d，缺血损伤的侧脑室下区、纹状体及皮质区可观察到Nestin蛋白表达增多，并于7 d时达到最大值;提示随着细胞微环境的改变，NSC可以被激活。该研究结果显示，大鼠脑缺血再灌注后Nestin阳性细胞增加，进一步证实了脑缺血损伤后内源性NSC的增殖。

腺苷是一种内源性嘌呤核苷酸，可通过激活相应的腺苷受体对受损脑组织发挥神经保护作用[10-12]。研究[13]表明腺苷可以明显增加 NSC的增殖，可在一定程度上改善实验动物脑缺血后的神经功能损伤。该研究结果显示，腺苷预处理组大鼠脑组织Nestin表达较模型组显著增加，提示腺苷预处理可促进内源性NSC的增殖，从而发挥脑保护作用，但其具体作用机制目前尚不清楚。Wnt1蛋白是成体干细胞的外源性调控因子，是一种富含半胱氨酸残基的分泌信号糖蛋白，参与调控动物胚胎发育、细胞命运及组织器官形态的形成[14-15]。近年来研究发现，在大鼠脑缺血再灌注时Wnt1的时间依赖性表达与NSC的增殖过程相吻合[16]，在应用Wnt信号通路特异性阻断剂后，脑缺血再灌注时NSC的增殖、分化受到明显抑制[17]，这些均表明Wnt蛋白具有调控 NSC增殖、分化的作用。该研究采用Western blot方法观察到假手术组大鼠海马区Wnt1蛋白表达极低，模型组与腺苷预处理组Wnt1蛋白的表达明显增加，腺苷预处理组Wnt1蛋白的表达明显高于模型组;提示腺苷可使脑缺血再灌注时脑组织中Wnt1蛋白表达上调;推测Wnt1蛋白可能在内源性NSC增殖过程中起着重要的正向调控作用。

综上所述，腺苷可能通过上调Wnt1蛋白的表达、促进内源性NSC增殖而改善脑缺血损伤后的神经功能，但其具体作用机制目前尚不清楚，仍需进一步深入研究。

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