深层海水对小鼠创面愈合的促进作用＊

李为明，崔 进△，徐鹏远，代佑果

（1.昆明医科大学第二附属医院干疗外科，昆明650101；2.昆明医科大学第三附属医院普外科，昆明650118）

创面修复是一个复杂而有序的过程，不仅涉及细胞自身的运动、黏附、通讯和分化等，也包含细胞内、外物质代谢和基因的启动、调控等一系列生化和分子生物学反应，影响上述过程的因素繁多，目前公认的两个重要因素是感染程度和营养状况。微量元素作为维持机体生命活动和组织细胞新陈代谢的重要物质，与其他营养成分一样，直接或间接参与到创伤修复过程中的细胞免疫、伤口愈合及抗氧化反应等多个环节，过多或不足都会影响创面的愈合［1］。深层海水是海平面200m以下的海水，其水质稳定而洁净，富含人体细胞所需矿物质及营养成分，病原菌也极少。本研究旨在利用深层海水富含平衡易吸收微量元素的特点，探讨其是否能够促进创面愈合，为创面修复提供新的方法，为进一步开发深层海水在临床上的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 深层海水的提取、处理及主要元素含量 在我国南海海域获取海平面200m以下的深层海水，避光运至昆明，室温避光储存，经超微过滤后，用铜锌合金（KDF）除去海水中的重金属，反复冻融方法浓缩并去除海水中多余的盐分浓缩海水，制备成生理性深层海水（physiological deep sea water，PDSW）常规检测主要元素的含量（表1），再稀释成45、90mg／mL的深层海水，供后述实验用。深层海水的硬度以如下公式计算［2］：硬度＝Mg（mg／L）×4.1＋Ca（mg／L）×2.5。

表1 PDSW中主要元素成分含量＊（mg／L）

1.2 实验动物及分组 昆明种雄性小鼠24只购自昆明医科大学实验动物中心，4周龄，体质量（18.0±2.0）g，选取同一窝次兄弟配对，避免遗传基因差别，组间差异无统计学意义（P＞0.05）。混合饲料单笼饲养，分为A组（深层海水）和B组（自来水），每组12只，实验前两组分别以深层海水和自来水给小鼠自由饮用14d，计算两组小鼠每日饮水、饮食量，术前1d背部脱毛。

1.3 方法

1.3.1 小鼠创伤模型建立 以戊巴比妥钠（40mg／kg）腹腔注射麻醉，在小鼠背部以1.0cm×1.0cm方格预定创伤面积，用眼科剪沿预定线修剪皮肤至肌肉筋膜表面，彻底止血、消毒，形成大小为1.0cm×1.0cm的创面。创面形成后A组以深层海水，B组以自来水自由饮用，混合饲料单笼饲养。

1.3.2 创面形态及愈合的观察 创伤手术后当天开始，每隔1天检测1次创伤恢复情况，直到创伤完全愈合为止。检测方法是用透明方格纸描绘创口，扫描入电脑后以专用软件Adobe Photoshop CS2测量创口面积，并根据创口面积变化来计算创口的愈合程度。计算公式：创面愈合率＝（创面面积－各时相点创面面积）÷创面面积×100%。

1.3.3 标本取材及处理 术后第3、5、7天分别取创缘组织，固定于4%多聚甲醛中，常规石蜡包埋切片，行常规HE染色，100倍光镜下观察染色切片。

1.4 统计学处理 采用Adobe Photoshop CS2及SPSS 17.0软件进行分析，计量资料以s表示，组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组小鼠饮水、饮食量比较 在相同的饲养条件下喂养14d，两组小鼠饮食、饮水量差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表2 小鼠14d饮食、饮水量（n＝12，x±s）

2.1 形态学观察 （1）A组：创伤后第3天，创面基底部可见较薄一层鲜红色的肉芽组织，触之易出血，创缘未见上皮生长，部分创面仍有少许淡黄色渗出，创面缩小不明显；创伤后第5天，创面被肉芽组织填充，表面呈颗粒状，肉芽组织较坚实，创面较前明显缩小，表面有痂皮覆盖（图1），可见白色新生上皮由四周向创面中心生长，创面基本无渗出物；创伤后第7天，创面迅速缩小，大部分痂皮剥落，表面由新生上皮覆盖；创伤后第10天，大部分创面完全愈合，张力稍大于周围皮肤。（2）B组：创伤后第3天，创面水肿，炎性渗液多，创面基底部有少量不完整的肉芽组织，颜色淡红，创缘无上皮生长，创面未见缩小；创伤后第5天，创面水肿减轻明显，渗出减少，由肉芽组织填充，创面较前缩小，表面有痂皮覆盖，部分小鼠创面有少量新生上皮由四周向创面中心生长（图2）；创伤后第7天，创面缩小较前明显，大部分创面仍有痂皮覆盖，小部分创面痂皮下按压有少许分泌物，痂皮周围创面由新生上皮覆盖；创伤后第12～13 d，创面完全愈合，张力大于周围皮肤明显。

2.2 创面愈合率 创面形成后第3天开始，A组小鼠的创面愈合率35.3%±1.3%高于B组34.4%±1.7%，但差异无统计学意义（P＞0.05）；创面形成后第5天开始，A组小鼠的创面愈合率55.1%±1.8%明显高于B组51.8%±1.2%，差异有统计学意义（P＜0.05）；创面形成后第7天，A组小鼠创面愈合率达87.1%±1.6%，B组愈合率为A组78.2%±2.2%，差异有统计学意义（P＜0.01），见图3。

图1 A组第5天

图2 B组第5天

图3

2.3 光镜观察 （1）A组：创伤后第3天新生的肉芽组织中血管内皮细胞增生，新生毛细血管生成，伴炎细胞浸润，成纤维细胞增生明显，核呈圆形或椭圆形，染色较深；创伤后第5天，炎症细胞浸润减少，成纤维细胞数量多，染色较深，毛细血管成分多（图4）；创伤后第7天，新生毛细血管及炎症细胞数量减少，成熟的成纤维细胞数量增多，细胞排列成束状，较为整齐，红染的基质成分均匀（图5）。（2）B组：创伤后3d炎症细胞浸润明显，少量内皮细胞，成纤维细胞数量较其他组少，排列紊乱；创伤后5d，肉芽组织中有少量毛细血管形成，细胞以炎症细胞为主，成纤维细胞虽较前增多，但比A组少，毛细血管少见（图6）；创伤后7d，炎症细胞逐渐减少，成纤维细胞明显增多，排列呈漩涡状，较为紊乱，见图7。

图4 A组第5天（HE×100）；

图5 A组第7天（HE×100）；

图6 B组第5天（HE×100）；

图7 B组第7天（HE×100）

3 讨 论

深层海水一般是指海平面200m以下的海水，水质稳定而洁净、富含人体细胞所需、成分比例组合与人体体液相似、人体极易吸收的矿物质成分，病原菌也极少。1996年日本学者Yoshiyuki［3］检测发现，深层海水含有82种元素，同时测出了各元素的含量。当前，深层海水已经应用在食品、农业、化妆品、医学等各领域，也有利用深层海水改善微量元素失衡来治疗特应性皮炎的报道［4］，而深层海水应用于创面的修复，目前国内外尚未见相关研究报道。

微量元素作为人体内重要代谢介质，参与人体数量众多的酶类和激素的合成与活化，除对机体的代谢、免疫、细胞分裂增殖等具有调控作用外，还可影响体内氧化还原反应，并参与细胞外基质合成与分解、成纤维细胞的形成与增生及细胞因子的生成与释放，其含量的变化一定程度上影响着机体的新陈代谢和创面的愈合。近年来国内学者发现，严重烧伤后血、尿液和局部组织中微量元素的含量均发生一些异常变化，这些变化可能对创面的修复过程带来许多不利影响，并认为诸多微量元素的变化，可能与创面修复期需求量增加、持续丢失与摄入不足等因素有关，及时补充微量元素，有利于恢复其正常浓度，促进创面愈合［5－8］。

创伤后血液和创面局部组织均可发生微量元素的异常，这一观点在医学界已基本得到认可。现市场出现各种补充微量元素的人工合成品（如：微量元素片），含量只有几种或几十种元素，人体内所有的微量元素都存在有直接或间接的关系，彼此相互影响，其相互作用错综复杂，因此，补充部分微量元素必然达不到预期效果，有时反而适得其反。深层海水含有人体所需、易吸收、平衡的所有元素，通过口服深层海水可以达到改善机体微量元素平衡。本研究中，首先给予小鼠口服深层海水14d，恢复机体的微量元素平衡后，在15d建立创伤创面模型，继续给予口服深层海水，改善因创伤导致的微量元素失衡，实验设计目的就是要充分利用深层海水来调节小鼠机体微量元素平衡。实验结果显示，在创伤后第3天就出现深层海水的促创伤愈合的优势，但此时差异无统计学意义（P＞0.05），考虑原因为微量元素是逐步调整的过程。在5d以后，深层海水组的创面愈合率较自来水组有明显提高。行组织学观察同时也发现深层海水组成熟的成纤维细胞数量增多，细胞排列成束状，较为整齐。

综上所述，深层海水可以促进创面的愈合，深层海水发挥作用的原因目前考虑为其丰富、易吸收、平衡的微量元素，下一步本研究将设计检测实验组和对照组创伤前后血液和局部微量元素的变化，以验证其理论。

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