白细胞介素－17在病毒性心肌炎中的表达及黄芪甲甙干预对其的影响＊

刘海英，刘丹莉，高顺利

（南华大学附属第一医院儿科，湖南衡阳 421001）

病毒性心肌炎（viral myocarditis，VMC）是由柯萨奇病毒B3（coxsackievirus B3，CVB3）等嗜心肌病毒引起的心肌炎症性疾病，近年来发病率呈上升趋势［1］。众多临床及动物实验证实细胞因子在VMC的发病机制中起重要作用。白细胞介素－17（interleukin－17，IL－17）是一种由 Th17细胞分泌的前炎症细胞因子，可诱导IL－6和肿瘤坏死因子－α（tumor necrosis factor－α，TNF－α）产生，具有强大的促炎作用［2］。已有研究发现，IL－17有助于VMC与自身免疫性心肌炎的发生、发展［3－4］。黄芪甲甙是从中药黄芪中提取的一单体成分，对VMC有较好的治疗效果［5］，然而，其抗VMC机制仍未完全阐明。为此，本研究通过CVB3感染Balb／c小鼠建立VMC动物模型，采用荧光实时定量PCR、免疫组化观察IL－17在VMC小鼠心肌组织中的表达情况，并以黄芪甲甙进行干预研究，从而探索IL－17在VMC

发病机制中的作用及黄芪甲甙的干预效果。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒 本实验使用CVB3为Nancy株，由复旦大学附属中山医院卫生部病毒性心脏病重点实验室提供，在Hela细胞中进行传代，然后离心，提取上清液，并检测50% 组织感染率（TCID50），TCID50为107，保存于－70℃冰箱备用，实验所用病毒剂量为1×102TCID50。

1.1.2 动物 Balb／c小鼠60只，4周龄，雄性，纯种，体质量12～16g，购于上海斯莱克实验动物有限公司，饲养于无特定病原体2000B017（SPF）条件下。

1.1.3 药物 黄芪甲甙粉剂（批号：0781－9706）购买于国家药物和生物制品检定研究所（NICPBP），不溶于水，用助溶剂羧甲基纤维素钠制成均匀悬液，根据预实验将浓度设置为0.01、0.09g／L。

1.2 方法

1.2.1 动物分组、模型制备及药物干预 60只Balb／c小鼠按随机数字表法分为4组：对照组、模型组、低剂量干预组以及高剂量干预组，每组15只。对照组小鼠仅腹腔注射0.1mL不含CVB3的病毒培养液，其余3组小鼠腹腔接种0.1mL内含1×102TCID50CVB3的病毒液，以诱发VMC，对照组和模型组于接种当日即用0.1mL羧甲基纤维素钠溶液灌胃，低剂量干预组和高剂量干预组分别以0.01、0.09g／L黄芪甲甙0.1 mL灌胃，每天灌胃1次，连续14d，并记录各组小鼠一般状况及每天存活数。第15天称体质量（BW）后断颈处死小鼠，摘取心脏，称心脏质量（HW），计算HW／BW，然后将小鼠心脏沿左心室中线切为两部分，一部分用甲醛固定、石碏包埋，用HE染色和免疫组化检测；另一部分迅速置于液氮中，再转移至－70℃冰箱冻存，用于总RNA的提取与ELISA检测。

1.2.2 HE染色 按常规方法进行HE染色，在200倍光镜下分析小鼠心肌病理学变化，参照文献［6］计算心肌病变（炎症浸润或坏死）积分：每张心肌切片随机选择5个高倍视野，计算每个视野中炎症细胞浸润或坏死区域面积与整个视野面积比值，0分表示无病理学改变，1分表示心肌病变面积小于25%，2分表示心肌病变面积为25%～50%，3分表示心肌病变面积大于50%～75%，4分表示心肌病变面积大于75%。

1.2.3 荧光实时定量PCR检测 采用美国Invitrogen公司生产的Trizol试剂提取小鼠心肌组织总RNA，溶于无Rnase水中，紫外分光光度计测定OD260／OD280的比值为1.8～2.0。取总RNA 2μg，用Fermentas公司逆转录试剂盒合成cDNA。按照文献［7］由上海生工生物技术有限公司合成引物序列。IL－17上游引物：5′－GTC AAT GCG GAG GGA AAG－3′，下游引物：5′－CAC GAA GCA GTT TGG GAC－3′，扩增产物长度349bp；β－actin上游引物：5′－CCA GCC TTC CTT CTT GGG TAT－3′，下游引物：5′－TTG GCA TAG AGG TCT TTA CGG－3′，扩增产物长度102bp。取10μL逆转录产物进行PCR反应，反应条件：94℃预变性3min，94℃变性45s，58℃复性30 s，72℃延伸45s，总共35个循环，72℃延伸10min。溶解曲线分析表明PCR反应产物为单独的双链DNA。用ΔΔCt值法，以β－actin表达为内参定量IL－17的表达。

1.2.4 Western blot检测 将心肌组织放入液氮碾磨，三去污裂解液裂解。利用BCA蛋白定量测定试剂盒（Hyclone－Pierce公司）检测蛋白水平，50μg蛋白与加样缓冲液混合，在10%不连续十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳胶中电泳分离，电转移至PVDF膜，孵育一抗（美国Santa Cruz公司）、二抗，以β－actin为内参照，用ECL发光法显色，曝光、显影、定影。胶片条带用薄层扫描仪进行扫描后，运用Imager2200软件分析各产物积分光密度值，计算IL－17蛋白表达水平。IL－17蛋白表达水平＝IL－17积分光密度值／β－actin积分光密度值。

1.2.5 ELISA检测 通过苯甲磺酰基氟化物（PMSF）将心肌组织匀浆，然后离心，提取上清液，利用ELISA试剂盒（深圳晶美生物工程公司）检测上清液中IL－6、TNF－α水平，严格按照说明书由专人进行操作。

1.3 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件进行统计学分析，多组均数比较行单因素方差分析及两两之间比较的q检验，率的比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 黄芪甲甙对小鼠死亡率与HW／BW的影响 在实验期间，对照组无小鼠死亡，模型组死亡率为46.67%（7／15），低剂量干预组死亡率为33.33%（5／15），高剂量干预组死亡率为20.00%（3／15）；高剂量干预组死亡率较模型组降低（P＜0.05），但低剂量干预组死亡率与模型组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。与对照组比较，模型组 HW／BW 明显增加（P＜0.01）；经黄芪甲甙处理后，高剂量干预组HW／BW较模型组降低（P＜0.05），然而低剂量黄芪甲甙对HW／BW无影响（P＞0.05），见表1。

2.2 黄芪甲甙对心肌病理组织学变化的影响 对照组心肌呈规则排列，未见到炎症细胞浸润和心肌细胞坏死；模型组出现大片心肌细胞坏死，周围可见众多炎症细胞浸润；低剂量干预组心肌病变程度与模型组相似；高剂量干预组坏死灶和炎性细胞浸润明显减少。与模型组比较，高剂量干预组炎症细胞浸润与心肌坏死积分显著降低（P＜0.01）；而低剂量干预组与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见图1、表1。

图1 各组心肌病理学改变（×200）

表1 各组死亡率、HW／BW及病理积分比较

2.3 黄芪甲甙对心肌IL－17mRNA表达的影响 条带密度扫描及半定量分析显示，模型组心肌组织中IL－17mRNA表达水平较对照组显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，经过高剂量黄芪甲甙处理后，其表达水平明显降低（P＜0.05）；低剂量干预组IL－17mRNA表达水平与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图2。

2.4 黄芪甲甙对心肌IL－17蛋白表达的影响 Western blot检测显示，模型组IL－17蛋白表达水平较对照组显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，经过高剂量黄芪甲甙处理后，IL－17蛋白表达水平明显降低（P＜0.05），但低剂量黄芪甲甙对其无明显影响（P＞0.05），见图3。

图2 各组小鼠心肌IL－17mRNA表达比较

图3 各组小鼠心肌IL－17蛋白表达比较

2.5 黄芪甲甙对心肌组织IL－6、TNF－α水平的影响 ELISA检测结果显示，模型组心肌组织中IL－6、TNF－α水平显著高于对照组（P＜0.01）；经高剂量黄芪甲甙处理后，IL－6、TNF－α水平较模型组明显降低（P＜0.05），但低剂量黄芪甲甙对上述指标无影响（P＞0.05），见图4、5。

图4 各组小鼠心肌IL－6水平比较

图5 各组小鼠心肌TNF－α水平比较

3 讨 论

IL－17是Th17细胞分泌的特征性因子，由155个氨基酸组成，相对分子质量为3×103，N端为19～23个氨基酸残基组成的信号多肽，其基因定位于染色体2q31。近年研究发现，IL－17是一种强大的前炎症因子，可诱导中性粒细胞的发育和成熟，并能刺激T细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、上皮细胞分泌多种炎症介质，如IL－1、IL－6、IL－8、TNF－α、一氧化氮合酶2、单核细胞趋化蛋白－1、生长调节因子α、金属蛋白酶及化学增活素等，从而诱导炎症反应［8］。Yuan等［9］报道，Th17细胞及血清IL－17水平在急性VMC患者中升高。Chang等［10］在心肌肌球蛋白诱导的实验性自身免疫性心肌炎中发现，心脏组织中IL－17、IL－17受体、IL－23表达均增加，其中以IL－17增加最为明显。有研究表明，IL－17在VMC小鼠心肌组织中表达显著升高，并且与心肌病变程度呈正相关［7］。本研究结果显示，在正常小鼠心肌组织中存在低水平的IL－17表达，当小鼠感染CVB3后，IL－17的表达量显著升高，与文献［7］报道一致，表明在生理条件下组成性表达的IL－17可能参与维持心脏结构与功能的平衡，而CVB3感染所致的IL－17过表达可能与VMC的发生、进发展密切相关。因此，抑制IL－17的表达及其介导的炎症反应可能成为治疗VMC的一个潜在的、有价值的靶点。

黄芪为一传统中药，具有补气升阳、益卫固表、利尿消肿、托毒生肌、益气理虚、伏正固本之功效。黄芪甲甙是黄芪注射液中的主要有效成分，它是一种黄芪皂甙类单体成分。众多实验不但发现其对实验性VMC动物模型疗效较好，而且已初步阐明其机制：抗病毒作用；抗心肌细胞凋亡作用［11］；下调心肌柯萨奇－腺病毒受体表达，从而减少CVB3对心肌细胞的亲和力［12］；抑制心肌细胞L型钙通道电流及钙超载［10］。然而，这种药物抗VMC的机制仍未完全阐明。本研究中，VMC小鼠给予高剂量黄芪甲甙干预治疗后，小鼠死亡率、HW／BW、炎症细胞浸润与心肌坏死病理积分降低，IL－17mRNA和蛋白表达水平显著下调，而低剂量黄芪甲甙干预治疗则无此作用，提示黄芪甲甙对VMC有良好的治疗作用，其机制可能与抑制IL－17表达有关。

炎症因子IL－6、TNF－α过表达在VMC的发生、发展中起重要作用。已有研究证实IL－17能促进IL－6、TNF－α分泌。Yang等［13］报道，腹腔注射IL－17单克隆抗体阻断IL－17的作用，可以明显改善VMC小鼠心肌病变程度，并下调心肌组织中IL－6、TNF－α的表达水平。为了进一步探讨黄芪甲甙治疗VMC的机制，作者通过ELISA检测了心肌组织IL－6、TNF－α水平，发现模型组心肌组织中IL－6、TNF－α水平显著高于对照组，经高剂量黄芪甲甙处理后，IL－6、TNF－α水平较模型组明显降低，提示黄芪甲甙对VMC的治疗作用可能与其抑制IL－17介导的炎症反应有关。

综上所述，本研究结果表明IL－17在VMC小鼠心肌组织中表达升高，提示IL－17可能参与了VMC的发病过程，黄芪甲甙对VMC治疗作用较好，这种作用可能与其抑制IL－17介导的炎症反应有关，可为黄芪甲甙的进一步开发应用打下基础。

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