EphB4和VEGF在食管癌中表达与其胸腔镜下根治术疗效的相关性研究

张明灿，游 凯，黄 一，张明静，陈虎平，裴家强，龚文清，游振飞

（1.解放军三二四医院心胸外科，重庆 400000；2.解放军后勤工程学院医院门诊部，重庆 400000）

食管癌是临床上较常见的消化道肿瘤，其发病率和致死率都较高。我国是食管癌的高发地区之一，每年的死亡人数在13万人以上。寻找食管癌的特异性表达因子不管是对临床疗效、预后的评定，还是对新的治疗方案的选择都具有非常重要的临床价值［1］。目前，肿瘤微血管密度（MVD）与实体肿瘤的关系越来越受到有关学者的关注。促红细胞生成素的肝细胞癌B4受体（EphB4）属于酪氨酸激酶受体家族的一员，在肿瘤的发生、发展过程中用起到重要的作用；血管内皮生长因子（VEGF）被认为是直接参与肿瘤血管生成的基因；MVD是反映肿瘤生物学行为的指标之一［2］。但是，食管癌组织中EphB4和VEGF的表达与MVD的关系仍尚未阐明，有关文献报道较少［3］。因此，本研究旨在探讨EphB4、VEGF在食管癌中的表达及其与血管密度的关系，并分析胸腔镜下行根治术的疗效，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2008年5月至2013年8月经行胸腔镜改良Ivor－Lewis根治术治疗的食管癌患者76例，其中男41例，女35例，年龄38～72岁，平均（56.24±17.35）岁。病理诊断为鳞癌50例，腺癌18例，腺鳞癌8例；TNM分期为Ⅰ期15例，Ⅱ期20例，Ⅲ期30例，Ⅳ期11例。并于术中采集全部患者食管癌组织标本及其对应的癌旁组织。

1.2 试剂与操作方法 EphB4兔抗人多克隆抗体（1∶50）由上海领成生物科技有限公司提供，VEGF单克隆抗体（1∶50）由福州迈新生物技术开发有限公司提供，CD34鼠抗人单克隆抗体（1∶50）由北京翰谱医药生物研究所提供，操作均按说明书进行。采用免疫组织化学法检测癌组织标本及癌旁组织中EphB4、VEGF、CD34的表达。用已知阳性标本作阳性对照，用PBS代替一抗作阴性对照。实验步骤按试剂盒说明书进行，DAB显色后用苏木素复染。

1.3 结果判断 EphB4、VEGF表达：以细胞质、细胞膜和血管内皮细胞中出现棕褐色颗粒为阳性细胞。MVD表达：参照Weidner［4］的方法，先用低倍镜寻找“热点”（血管密集区），换用高倍镜，随机选择5个不同视野以计数微血管数（直径大于50 μm或管壁含有肌层则不计入范畴），算出平均值为MVD值。

1.4 统计学处理 采用SPSS15.0统计软件进行分析，计数资料以率表示，采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 EphB4和VEGF在食管癌及癌旁组织中的表达情况EphB4、VEGF的阳性表达主要位于细胞质，其次为细胞膜和血管内皮细胞，见图1、2。EphB4、VEGF在癌组织的阳性表达率分别为57.89%、61.84%显著高于癌旁组织的0和7.89%（P＜0.05）。见表1。

图1 EphB4在食管癌组织中的表达（×200）

2.2 EphB4、VEGF表达与 MVD的关系 食管癌EphB4表达阳性率为57.89%（44／76），200倍视野下，MVD为（28.24±6.32）个，以28个为界，评定大于28个为 MVD高组，小于或等于28个为 MVD低组；VEGF表达阳性率为61.84%（47／76），200倍视野下，MVD为（36.15±8.73）个，以36个为界，评定大于36个为MVD高组，小于或等于36个为MVD低组。其中高组的EphB4、VEGF阳性表达率分别为67.44%、76.19%显著高于低组的45.45%、44.11%（P＜0.05）。见表2。

表1 EphB4和VEGF在食管癌及癌旁组织中的表达情况

图2 VEGF在食管癌组织中的表达（×200）

2.3 EphB4、VEGF表达与患者临床疗效的关系 有淋巴结转移组和有复发组的EphB4、VEGF表达阳性率分别为80.00%、82.22%和65.21%、72.00%，显著高于无淋巴结转移组和无复发组的45.16%、58.06%和32.08%、37.25%，差异有统计学意义（P＜0.05）；大于或等于5年生存率的患者中EphB4、VEGF表达阳性率分别为45.00%和45.45%，显著低于小于5年生存率的患者80.36%和85.19%，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 EphB4、VEGF表达与患者临床疗效的关系

3 讨 论

目前已有文献报道，EphB4在多种癌组织中呈高表达，但在对应的癌旁组织中却低表达，甚至不表达，如：前列腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌及膀胱癌等［5－6］。本研究中，应用免疫组织化学法对76例食管癌和癌旁组织中EphB4的表达进行检测，结果发现，癌组织中44例呈阳性表达，而癌旁组织中阳性表达为0例，这与上述报道相吻合。但VEGF除了在癌组织中高表达外，还在癌旁组织呈少量表达。本研究结果显示，VEGF在癌组织中的阳性表达主要位于细胞质和细胞膜，阳性表达率为61.84%，在癌旁组织的阳性表达率为7.89%。这与产松苗等［7］的报道相似。EphB4和VEGF不仅参与食管癌血管的生成，还与淋巴结转移、复发及术后5年生存率有关［8］。本研究结果显示，EphB4和VEGF阳性表达组的淋巴结转移和复发的发生率均显著高于EphB4和VEGF阴性表达组；大于或等于5年生存率的患者中EphB4、VEGF表达阳性率分别为45.00%和45.45%，显著低于小于5年生存率的患者的80.36%和85.19%。说明，胸腔镜下根治术后EphB4和VEGF阳性表达的患者，易出现淋巴结转移和复发，且5年生存率较低；亦提示EphB4和VEGF阳性表达者术后疗效较差［9］。MVD在肿瘤生长、侵袭及转移的过程中起着重要的作用。CD34是血管内皮细胞的特异性标志物，通过免疫组织化学CD34染色判断可测定 MVD，从而可反映肿瘤组织血管密度的表达水平，且特异性和敏感性更强［10］。本研究结果发现，MVD高的患者EphB4、VEGF阳性表达率分别为67.44%和76.19%，显著高于MVD低的患者45.45%和44.11%。说明EphB4和VEGF均可促进食管肿瘤血管生成［11］。

综上所述，EphB4和VEGF在食管癌中高表达，与血管密度密切相关，与淋巴结转移、复发及患者5年生存率有关；EphB4和VEGF阳性表达者术后疗效较差。

［1］Zampeli E，Karamanolis G，Morfopoulos G，et al.Increased expression of VEGF，COX－2，and Ki－67in Barrett′s esophagus：does the length matter［J］.Dig Dis Sci，2012，57（5）：1190－1196.

［2］Das A，Shergill U，Thakur L，et al.Ephrin B2／EphB4 pathway in hepatic stellate cells stimulates Erk－dependent VEGF production and sinusoidal endothelial cell recruitment［J］.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2010，298（6）：908－915.

［3］郑庆丰，柳硕岩，王海燕，等.EphB4及其配体EphrinB2在食管鳞癌中表达及其与血管生成的关系［J］.中国肿瘤临床，2013，20（10）：579－582.

［4］Weidner N.Current pathologic methods for measuring intratumoral microvessel density within breast carcinoma and other solid tumors［J］.Breast Cancer Res Treat，1995，36（2）：169－180.

［5］肇丽杰，王永来.EphB4受体及其配体EphrinB2mRNA在子宫内膜癌组织中的表达及意义［J］.中国妇幼保健，2008，23（35）：5049－5051.

［6］韩景田，马玉珍，张诗武，等.酪氨酸蛋白激酶EphB4受体在几种癌组织中的表达［J］.武警医学院学报，2006，15（1）：35－36，39.

［7］产松苗，欧希龙，孙为豪，等.食管癌组织血管内皮生长因子的表达与血管生成的关系［J］.江苏医药，2011，37（17）：2034－2037.

［8］Hasina R，Mollberg N，Kawada I，et al.Critical role for the receptor tyrosine kinase EPHB4in esophageal cancers［J］.Cancer Res，2013，73（1）：184－194.

［9］Jadlowiec CC，Feigel A，Yang C，et al.Reduced adult endothelial cell EphB4function promotes venous remodeling［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2013，304（7）：627－635.

［10］Gray RT，O′Donnell ME，McGuigan JA，et al.Quantification of tumour and circulating vascular endothelial growth factor（VEGF）in patients with oesophagogastric cancer：a long－term follow－up study［J］.Br J Biomed Sci，2012，69（2）：71－75.

［11］Martiny－Baron G，Holzer P，Billy E，et al.The small molecule specific EphB4kinase inhibitor NVP－BHG712inhibits VEGF driven angiogenesis［J］.Angiogenesis，2010，13（3）：259－267.