回药烫伤膏中大黄与黄芩提取工艺研究

王瑞红，王 荣，牛 阳，毛跟年，张跃进＊，杜 磊

（1.西北农林科技大学，陕西杨凌712100；2.宁夏医科大学，宁夏银川750004；3.陕西科技大学，陕西西安710021）

浅Ⅱ度烧烫伤累及表皮全层及真皮浅层，其特征是表皮与真皮分离，渗出物积聚于其中而形成皮下水疱［1］。中医学认为由于强热的作用，热盛则肉腐，以致皮肤溃烂，火热迫血妄行而逸出于脉外，则形成瘀血，故治疗上以活血祛瘀、清热解毒、祛腐生肌为主［2－3］。回药烫伤膏以回医药具有特色的芳香药物为主，并用草本之具有“长性”药物入于湿性，以滋润红液质，并用芳香药物中具有活血之药，促使“木”之长性显用，并推动“活”之运动彰显，运之于脏腑，动之于四肢百骸，兼行气血，可促进创面肉芽形成，明显减少创面感染的几率，加速创面愈合，缩短病程［5］。具有清热解毒作用的黄柏、大黄和黄芩为烫伤膏中的臣药，其有效成分的利用程度可直接影响烫伤膏的药效。本文以烫伤膏处方为基础，采用乙醇回流法对大黄与黄芩进行合并提取［5－7］，以综合得分为考察指标，研究大黄和黄芩的提取工艺，以便为烫伤膏的生产奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料 黄芩饮片、大黄饮片，西安鸣鹿药业有限公司提供。

1.1.2 试剂 黄芩苷对照品（批号201305）、大黄素对照品（批号201302），西玛实验室提供。

无水乙醇、盐酸、丙酮、氢氧化钠、硅胶G、碘化铋钾试剂、三氯化铁、醋酸铅、苯、甲酸乙酯、甲酸、镁粉、正丁醇、冰醋酸等均为分析纯试剂；CMC－Na为化学纯试剂。

1.1.3 主要仪器设备 岛津UV－240分光光度计，SHZ－D（III）型循环水式真空泵，RE－52A 型旋转蒸发仪，HH－2型数显恒温水浴锅，DHG－9123A型烘箱，BL610型电子分析天平等。

1.2 方法

1.2.1 标准溶液的制备 精密称取干燥至恒重的大黄素对照品1.06mg和黄芩苷对照品1.03mg，分别置于50mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为0.021 2mg／mL的大黄素标准溶液和0.020 6mg／mL的黄芩苷标准溶液。

1.2.2 最大吸收波长的确定 取大黄素和黄芩苷标准溶液各1mL分别置于10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，大黄素在200nm～600nm波长进行扫描测试，黄芩苷在200nm～500nm波长扫描。同法取大黄和黄芩合提物的甲醇溶液在200 nm～60 0nm波长进行扫描。

1.2.3 标准曲线的制备 分别精确量取大黄素和黄芩苷标准溶液0.5、1、2、4、6、8mL于10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，分别于222nm和278nm波长处测定吸光度，以吸光度A为纵坐标，以大黄素和黄芩苷浓度（μg／mL）C为横坐标绘制标准曲线。

1.2.4 稳定性试验 取大黄素和黄芩苷标准溶液各1份，分别以222nm和278nm波长在室温下于15、30、45、60、75、90、105、120min时测定吸光度。

1.2.5 精密度试验 精确吸取6份大黄素及黄芩苷标准溶液各1mL，置于10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，以甲醇为空白，分别在222nm和278 nm处测定吸收度。

1.2.6 重复性试验 精密吸取供试品溶液，在222 nm和278nm波长处重复测定吸光度6次。

1.2.7 加样回收率试验 精密量取已知大黄素含量和黄芩苷含量的提取液样品12份各1mL，其中6份样品中各加入大黄素对照品溶液0.5mL（0.021 2mg／mL），其余6份样品中分别加入黄芩苷对照品溶液0.5mL（0.020 6mg／mL），在222nm波长下测定大黄素含量，在278nm波长下测定黄芩苷含量，计算加样回收率。

1.2.8 大黄和黄芩提取方法的确定 根据回药烫伤膏配方中各原料药的性质，本文确定大黄和黄芩用乙醇溶液进行合并提取，采用多指标综合加权评分法对提取效果进行评价。

综合得分＝提取液中大黄素含量×0.3＋提取液中黄芩苷含量×0.3＋干膏率×0.4。

在乙醇浓度、加料量、溶剂用量相同的条件下，首先通过预试验对回流法、超声法和冷浸法的提取效果进行了比较，确定提取方法。

称取大黄和黄芩饮片，分别粉碎成粗粉，过20目筛，按回药烫伤膏配方中大黄与黄芩的比例称取大黄和黄芩粗粉各12g，放入圆底烧瓶中，加入乙醇溶液回流提取数次，合并提取液，置于干燥至恒重的蒸发皿中水浴蒸发至干，再于干燥箱中105℃干燥至恒重，即得干膏，计算干膏率。

1.2.9 单因素试验 采用乙醇回流法对乙醇浓度（550、600、650、700、750mL／L）、提取时间（0.5、1、1.5、2、2.5h）、乙醇用量（4、6、8、10、12）、提取次数进行了考察，以综合得分为考察指标，结果表明提取次数对考察指标影响较小，其余各因素均得到对考察指标影响较大的三个水平。故后续试验选择乙醇浓度、乙醇用量及提取时间为因素，用正交试验对提取条件进行优选。

1.2.10 正交试验 根据单因素考察结果，固定提取次数为2次，对乙醇浓度（600、650、700mL）、乙醇用量（6、8、10）和提取时间（1、1.5、2h）采用乙醇回流法进行L9（34）正交试验，以综合得分为考察指标优化提取条件。

1.2.11 验证试验 取大黄和黄芩饮片各12g，共3份，粉碎成粗粉，过20筛，用8倍量的600mL／L乙醇回流提取2次，每次提取1.5h，测定大黄素含量、黄芩苷含量及干膏率，计算综合平分。

2 结果

2.1 最大吸收波长

在278nm处黄芩苷有最大吸收、在222nm处大黄素有最大吸收，最终确定大黄素和黄芩苷的测定波长分别为222nm和278nm（图1、图2和图3）。

图1 大黄素对照品紫外光谱图Fig.1 UV spectrum of emodin reference sample

图2 黄芩苷对照品紫外光谱图Fig.2 UV spectrum of baicalin reference sample

图3 样品提取液紫外光谱图Fig.3 UV spectrum of the sample extract

2.2 标准曲线的制备

大黄素回归方程为：A＝0.098 3C－0.017 2，r＝0.999 1，线性范围1.93μg／mL～9.67μg／mL；黄芩苷回归方程为：A＝0.104 2C－0.013 2，r＝0.999 5，线性范围2.06μg／mL～12.83μg／mL。

2.3 稳定性试验

大黄素对照品的RSD为0.63%，黄芩苷对照品的RSD为0.78%，表明大黄素和黄芩苷对照品溶液在120min内稳定性良好。

2.4 精密度试验

大黄素RSD为0.30%，黄芩苷RSD为0.39%，表明精密度良好。

2.5 重复性试验

大黄素的RSD为0.79%，黄芩苷的RSD为0.62%，表明测定结果的重现性良好。

2.6 加样回收率试验

大黄素的平均回收率为103.4%（RSD为1.55%），黄芩苷平均回收率为98.85%（RSD 为0.92%）。

2.7 大黄和黄芩提取方法的确定

回流法提取效率高于超声法和冷浸法，故确定采用乙醇回流法进行提取。

2.8 正交试验

试验结果的直观分析和方差分析见表1和表2。

由正交试验结果可知，3个因素对提取工艺影响大小的顺序为A（乙醇浓度）＞B（乙醇用量）＞C（提取时间）；方差分析结果显示：因素A（乙醇浓度）对综合指标的影响有显著性差异，而因素B（乙醇用量）和因素C（提取时间）的影响未达到显著性差异。由正交试验得出的最优提取条件是A1B2C2，即用8倍量600mL／L乙醇回流提取2次，每次提取1.5 h。选择A、B、C三因素进一步进行验证试验。

2.9 验证试验

验证试验结果见表3。

表1 大黄与黄芩醇提工艺正交试验结果Table 1 The orthogonal test results of Rhubarb and Scutellariaalcohol extraction process

表2 大黄与黄芩醇提工艺方差分析结果Table 2 The variance analysis of Rhubarb and Scutellariaalcohol extraction process

表3 验证试验结果Table 3 Verification of test results

由表3试验结果可知，在最佳提取工艺A1B2C2下对大黄和黄芩进行乙醇回流提取，三次提取结果的重复性较好，均与正交试验结果相近，表明正交试验所得的提取工艺合理可行。

3 讨论

根据回药烫伤膏处方中大黄、黄芩及黄柏所含有效成分的理化性质，三者合提时黄柏中的盐酸小檗碱易与大黄中的蒽醌及黄芩中的黄芩苷形成盐而沉淀析出，降低有效成分的提取率和药效［8］。而大黄中的蒽醌和黄芩中的黄芩苷均呈酸性，性质相似，因此在本处方有效成分提取时，大黄与黄芩进行合并提取，黄柏采用单提工艺。且经过本试验证明，大黄与黄芩合提取得了较为理想的效果。

大黄和黄芩所含的化学成分复杂，在有效成分提取时，选用的含量指标大黄为大黄素、黄芩为黄芩苷，两味药在处方中的用量相同，且在处方中均为臣药［4］，故考虑含量指标时将大黄素与黄芩苷以相同的权重系数进行处理。此外，由于本试验的目的是为烫伤膏的制备提供合格原料，因此还需要在提取工艺中考虑干膏率。所以本提取工艺考察时选择多指标综合加权评分进行评价。考虑到有效成分含量指标的重要性，最终选取提取液中大黄素含量∶提取液中黄芩苷含量∶干膏率的权重系数为0.3∶0.3∶0.4。

采用紫外分光光度法测定大黄素和黄芩苷含量具有方法简便、快速、选择性强、线性范围宽、重现性好等优点，有利于提高了试验效率，适用于回药烫伤膏中大黄和黄芩合提时大黄素与黄芩苷含量的测定。

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