鸡肠道大肠埃希菌的分离鉴定及对噬菌体的敏感性测定

邹 玲，刘晓飞，任慧英

（青岛农业大学动物科技学院，山东青岛266109）

随着集约化养禽业的发展，大肠杆菌病已成为危害养禽业的重要细菌病。目前对大肠杆菌病主要是利用抗生素进行预防和治疗，随着抗生素的大量使用，致病性大肠埃希菌（大肠杆菌）对药物的敏感性逐渐降低，耐药谱不断扩大，治疗效果显著下降［1］。而多数养殖场饲养管理过程中滥用抗生素现象普遍存在［2］，更有甚者，将兽药用作饲料添加剂来降低动物发病率与死亡率、提高饲料利用率、促进生长和改善产品品质，这都将导致畜产品兽药残留［3］。据相关资料记载和报道，禽源大肠埃希菌的血清型众多，目前国外报道的血清型已达160多种［4－5］，且菌株之间缺乏完全保护，研制出具有高保护力的大肠埃希菌疫苗十分困难。鉴于新抗菌药物研发的速度远远低于耐药菌产生的速度，寻找代替抗生素治疗细菌性疾病的策略成为解决该问题的有效途径［6－7］，噬菌体具有高度特异性，不会影响到其他的菌群，不会破坏体内微生态的平衡、导致其他耐受性致病菌的生长，也很少引起胃肠道反应、过敏反应等［8］。因此，噬菌体作为一种生物抗菌剂，比抗生素在细菌性疾病的治疗和预防方面更有优势，越来越广泛地受到人们的关注［9］。

本试验拟分离不同健康鸡群肠道正常菌群的大肠埃希菌，测定对鸡致病性大肠埃希菌具有裂解作用的噬菌体能否裂解鸡肠道正常菌群的大肠埃希菌。研究结果可为临床上应用噬菌体制剂进行大肠杆菌病的预防及治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及噬菌体 5株鸡源致病性大肠埃希菌分离株（血清型分别为 O15、O24、O78、O93，另有一株未定型）；8株噬菌体Bp2、Bp3、Bp4、Bp5、Bp6、Bp7、Bp8、Bp9，均由青岛农业大学动物科学学院兽医微生物实验室保存。

1.1.2 主要试剂及培养基 普通营养琼脂培养基；LB肉汤液体培养基、SS琼脂培养基、伊红美蓝培养基、三糖铁培养基、枸橼酸盐培养基、胰蛋白胨水培养基，北京陆桥技术有限责任公司产品；葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖微量生化管，杭州天和微生物试剂有限公司产品；葡萄糖蛋白胨水、吲哚试剂、MR试剂、V－P试剂；革兰染液由本实验室配制。

1.2 方法

1.2.1 材料采集 自青岛10个蛋鸡养殖场无菌采集健康蛋鸡泄殖腔拭子28份，立即放入无菌EP管中，每个饲养群体采集1份。

1.2.2 细菌的分离 分别将采集的样品在SS培养基上划线分离，于37℃过夜培养后，挑取粉红色单菌落，再培养纯化，置于4℃冰箱保存备用。

将纯化后的单菌落接种伊红美蓝琼脂培养基，于37℃培养24h后，观察菌落特征。挑取多次划线所得单菌落进行革兰染色，显微镜检查。

1.2.3 生化试验 按常规方法在无菌条件下，用接种针将分离纯化的疑似大肠埃希菌单菌落分别进行五糖（葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖）发酵、三糖铁试验、IMViC试验。

1.2.4 大肠埃希菌对噬菌体的敏感性测定

1.2.4.1 菌悬液的制备 分别挑取28株菌的单菌落分别接种于1号～28号盛有5mL LB肉汤的试管中，37℃、160r／min振荡培养8h，即得到菌悬液。

1.2.4.2 单斑法测定大肠埃希菌对噬菌体的敏感性［10］取100μL菌悬液分别均匀涂布于普通琼脂平板上，用微量移液器分别取2μL噬菌体悬液滴于平板的不同位置上，加样时，各种噬菌体悬液间不能有接触，以免影响试验结果。待自然干燥后37℃培养6h～8h，观察结果。

1.2.4.3 双层平板法测定大肠埃希菌对噬菌体的敏感性［11］分别将噬菌体和菌悬液的混合液加入至已融化的上层琼脂培养基中（55℃）立即旋摇，混匀后将上层培养基迅速对号倒入已准备好的底层琼脂上，轻摇平板，使上层培养基铺满平板，待其凝固后，37℃倒置培养6h～8h，观察结果。

1.2.5 动物致病性试验 将1.2.4中所测的对噬菌体敏感的菌株、随机选择一株对8株噬菌体均不敏感的菌株及一株鸡致病性大肠埃希菌分别接种LB肉汤，37℃、160r／min振荡培养8h后作为致病力试验用菌液，每株菌接种2只小鼠，每只小鼠腹腔注射1mL，共分4组，致病性大肠埃希菌组为阳性对照，未注射组为阴性对照，接种后隔离饲养。随时观察并记录死亡情况，及时剖检死亡小鼠，观察病理变化并分离细菌。

2 结果

2.1 培养特性

经37℃培养24h～48h后，分离菌在SS琼脂上形成红色、圆形隆起、光滑湿润、边缘整齐的小菌落；在伊红美蓝琼脂上形成紫黑色、具有金属光泽的小菌落。

2.2 革兰染色

取28个伊红美蓝琼脂平板上黑色带金属光泽的单个菌落涂片，革兰染色后镜检可见到革兰阴性、两端钝圆的短杆菌，无芽胞。

2.3 生化试验

2.4 对噬菌体的敏感性测定

2.4.1 单斑法测定噬菌体敏感性 由观察结果可知，Bp4、Bp7、Bp8、Bp9可裂解9号大肠埃希菌，Bp5、Bp6疑似可裂解26号大肠埃希菌，Bp9疑似可裂解28号大肠埃希菌。BP2、BP3对所有菌株都不裂解，有待于用双层平板法进一步验证。

2.4.2 双层平板法测定噬菌体敏感性 由结果可知，Bp4、Bp7、Bp8、Bp9 可裂解9号大肠埃希菌，BP2、BP3、BP5、BP6对所有大肠埃希菌都不裂解，与单斑法结果相比，26号、28号可疑噬菌斑在双层平板法中均无噬菌斑产生。

2.5 动物致病性试验

将致病性大肠埃希菌及在噬菌体敏感性测定中对噬菌体敏感和不敏感的菌株分别接种小鼠。接种小鼠6h以后开始出现症状，表现精神沉郁，被毛粗乱，食欲下降，呼吸急促，不愿走动。剖检死亡小鼠，有肺充血、出血，肝肿大等症状。接种10h后开始出现死亡，接种阳性对照株的两只小鼠的死亡时间分别为10h和16h；接种9号菌株小鼠的死亡时间分别为19h和12h；接种14号菌株小鼠的死亡时间为36h；接种阴性对照的小鼠表现正常。3株大肠埃希菌毒力强弱顺序为阳性对照＞9号＞14号。

从死亡小鼠肝脏中进行大肠埃希菌的分离培养，结果在SS培养基上得到了红色菌落，对分离的单菌落进行噬菌体敏感性测定，与双层平板法所得结果一致，说明分离到的大肠埃希菌即是所接种的大肠埃希菌。对4株噬菌体敏感的9号大肠埃希菌致病力强于对8株噬菌体均不敏感的14号大肠埃希菌而稍弱于阳性对照，可能为致病性大肠埃希菌。

3 讨论

3.1 关于正常菌群大肠埃希菌的分离

从本次分离试验结果来看，经形态观察和生化鉴定，最终确定从健康鸡泄殖腔拭子中分离到的28株菌均为大肠埃希菌。可见本试验通过采集健康鸡群肛拭子并从中分离正常菌群中大肠埃希菌的方法是可行的。

3.2 关于对噬菌体的敏感性测定及动物致病性试验

单斑法测定中对噬菌体疑似敏感的26号、28号菌在双层平板法中并未出现噬菌斑。这个结果说明单斑法虽然操作简单，但相对于双层平板法而言，准确性较差。原因可能是菌液涂布不均或是噬菌体扩散范围不一，有待于改进。

在28株大肠埃希菌对8株噬菌体的敏感性测定中，只有9号菌对其中4株噬菌体敏感。而由动物致病性试验结果可知，对噬菌体敏感的9号大肠埃希菌致病力仅次于阳性对照，接菌后24h内小鼠即死亡，说明9号菌可能为致病性大肠埃希菌，但进一步确定仍需做血清型鉴定。由此可见，从健康鸡肛拭子中分离出的大肠埃希菌并不一定是正常菌群的大肠埃希菌。

敏感性测定结果显示可裂解致病性大肠埃希菌的噬菌体具有特异性，不会破坏正常菌群的大肠埃希菌。Chennoufi S C等［12］曾进行体外和体内的大肠埃希菌噬菌体溶菌活动研究，研究结果显示，在体外对噬菌体不敏感的的大肠埃希菌在体内也不会被噬菌体裂解，而且由于噬菌体本身所具有的特性，其可作为抗生素的替代品用于治疗细菌病，将抗生素和噬菌体制剂联合使用可能会更好［13］。

［1］ Thongkoom P，Kanjanahareutai S，Chantrakooptungool S，et al.Vancomycin resistant enterococci（VRE）isolates isolated in Rajavithi Hospital between 1999and 2009［J］.J Med Assoc Thailand，2012，95（S3）：S7－S15.

［2］ 吴海港，张文建，王春梅.皖北地区鸡致病性大肠埃希菌的分离鉴定及药敏实验［J］.中国饲料，2011（1）：11－12.

［3］ 王 东，王旭青，王建波，等.3株鸡大肠埃希菌地方分离株I型菌毛的免疫原性［J］.动物医学进展，2012，33（12）：68－71.

［4］ 张燕飞，王 东，王玉炯，等.宁夏部分地区鸡大肠埃希菌的分离与血清型鉴定［J］.动物医学进展，2012，33（5）：119－121.

［5］ 李惠兰，孙永祥，吴洪涛，等.辽宁省禽大肠埃希菌优势血清型菌株致病性试验研究［J］.现代畜牧兽医，2012（9）：29－30.

［6］ Vieira A，Silva Y J，Cunha A.Phage therapy to control multidrug resistant pseudomonas aeruginosa skin infections：in vitro and ex vivo experiments［J］.Eur J Clin Microb Infect Dis，2012，3（11）：3241－3249.

［7］ Glukhov A S，Krutilina A I，Shlyapnikov M G，et al.Genomic analysis of pseudomonas putida phage tf with localized singlestrand DNA interruptions［J］.PLoS One，2012，7（12）：e51163.

［8］ Loc Carrillo C，Abedon S T.Pros and cons of phage therapy［J］.Bacteriophage，2011，1（2）：111－114.

［9］ Sheng H，Knecht H J，Kudva I T，et al.Application of bacteriophages to control intestinal Escherichia coli O157：H7levels in ruminants［J］.Appl Environ Microbiol，2006，72（8）：5359－5366.

［10］ Barrow P，Lovell M，Berchieri A Jr.Use of lytic bacteriophage for control of experimental Escherichia coli septicemia and meningitishin chicken and calves［EB／OL］.Clin Vac Immunol，1998，5：294－298.

［11］ Glukhov A S，Krutilina A I，Shlyapnikov M G，et al.Genomic analysis of pseudomonas putida phage tf with localized single strand DNA interruptions［J］.PLoS One，2012，7（12）：e51163.

［12］ Catherine L C，Abedon S T.Pros and cons of phage therapy［J］.Bacteriophage，2011，1（2）：111－114.

［13］ 逯 凯，颜 晨，任慧英.T4噬茵体蛋白的分子改造及其应用前景［J］.动物医学进展，2012，33（4）：97－102.