海藻酸钠-壳聚糖固定化胃蛋白酶的研究

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(1.东北农业大学食品学院,黑龙江哈尔滨 150030； 2. 东北农业大学国家大豆工程技术研究中心,黑龙江哈尔滨 150030)

海藻酸钠-壳聚糖固定化胃蛋白酶的研究

李晓静1,侯俊财1,*,江连洲1,朱秀清2,韩宗元1,吴瑶1,张佳秀1,高梦妮1,韩巍巍1,曹秋阁1,耿浩1

(1.东北农业大学食品学院,黑龙江哈尔滨 150030； 2. 东北农业大学国家大豆工程技术研究中心,黑龙江哈尔滨 150030)

采用海藻酸钠-壳聚糖包埋交联法对胃蛋白酶进行固定化。以固定化酶的活力回收率为指标,探讨了固定化的条件及固定化胃蛋白酶与游离胃蛋白酶的酶学性质。结果表明：最优固定化条件为,海藻酸钠浓度为3.40%,壳聚糖浓度为3.39%,CaCl2浓度为3.64%,游离酶稀释倍数20倍,交联时间4h,固定化酶回收率74.87%±1.07%；固定化酶的最适温度47℃,最适pH3.5；得到的固定化酶的操作稳定性和热力学稳定性都较好,该固定化酶重复使用5次后,活力仍可以保持62%以上。

海藻酸钠,壳聚糖,胃蛋白酶,固定化酶

酶作为一种天然的高效催化剂,已得到了广泛的应用,但游离酶具有不稳定与易变性等缺点,使产品的生产成本居高不下,这极大限制了其在食品工业化生产中的应用[1]。固定化技术是20世纪中期发展起来的一项新型生物技术,起步于20世纪50年代,于1971年第1届国际酶工程(EnzymoEngineerin)会议上正式采用了“固定化酶”的名称[2]。近年来,固定化酶的载体和研究方法都有了很大的进展,在现代食品行业、医药工业、能源开发等环境领域都得到了广泛的应用。固定化酶是用一定的材料将活性酶束缚或限制于一定的区域内,但仍能进行酶所特有的催化反应,并可回收及重复使用的一种新技术[1],制得的固定化酶具有很高的稳定性,在反应过程中容易控制,可反复循环利用,延长了酶的使用期限,同时增强了酶的使用效率,并降低了生产成本。 制备固定化酶的方法有很多种,其中包埋法制备固定化酶是不需要化学修饰酶蛋白的氨基酸残基,且具有反应条件温和、酶活力损失小等优点,是常用于制备固定化酶的方法。吴国杰等[2]探讨了海藻酸钠-壳聚糖固定化载体的制备及应用研究,对各因素的影响进行了探讨,为海藻酸钠-壳聚糖作为载体提供了理论依据,并充分说明壳聚糖-海藻酸钠作为固定化载体的可行性。高尚欣等[11]探讨了海藻酸钠-壳聚糖共固定化菠萝茎蛋白酶的研究,对影响因素进行研究,详细说明了各个条件的关键点。张佳宁等[7]探讨了壳聚糖-海藻酸钠固定化磷脂酶A2的研究,对制备过程中不同条件对结果的影响进行了研究,为以后固定化酶打下良好的基础。鉴于海藻酸钠和壳聚糖均是无毒、生物相容性好、可生物降解的天然高分子材料,且具有一定的保健功能[2]。所以常用海藻酸钠、壳聚糖作为包埋材料,制备固定化酶[3-4]。胃蛋白酶是从猪、牛或羊的胃粘膜中提取的,为白色粉末,无霉败臭味,有引湿性,水溶液呈酸性的一种消化性动物蛋白酶[5],适宜在酸性条件水解蛋白肽类。常用于助消化类的药物中,又因其水解后的产物利于消化吸收,抗氧化性较好,被广泛应用在水解植物蛋白中,但因其稳定性差,易受外界影响变性失活,且酶与底物混合反应后难以回收利用,增加了生产成本。且酶与反应产物混在一起,也给产物的后续分离纯化带来了不便,固定化酶相比于游离酶对热、pH等条件的稳定性有所提高,而且对酶抑制剂的敏感性降低,易于分离,改善了后处理过程[6]。本实验主要以壳聚糖-海藻酸钠为载体,固定化胃蛋白酶,以提高酶的利用率,并对海藻酸钠浓度、壳聚糖浓度、CaCl2浓度和交联时间等因素对固定化胃蛋白酶活力回收率的影响进行研究,最终优化出酶的最佳固定化条件。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

海藻酸钠(脱乙酰度 85%) 天津市远航化学药品有限公司经销；壳聚糖 国药集团化学试剂有限公司；戊二醛(50%) 天津市耀华化学试剂有限责任公司；胃蛋白酶(1∶3000) 中国惠世生化试剂有限公司上海；酪蛋白 北京奥博星生物技术有限责任公司；乳酸和冰乙酸 天津市富宇精细化工有限公司；碳酸钠和乳酸钠 天津市巴斯夫化工有限公司；三氯醋酸 江苏市永华精细化学品有限公司；其他试剂均为分析纯试剂或生化试剂(市售)。

LGJ-1 型冷冻干燥机 上海医用分析仪器厂；恒温水浴锅 北京市永光明医疗仪器厂；UV759CRT型紫外可见分光光度计 上海佑科仪器公司。

1.2实验方法

1.2.1 固定化胃蛋白酶的制备方法 称取一定量的海藻酸钠加水50mL,在37℃水浴锅中保温溶解一段时间,向海藻酸钠溶液中加入5mL用pH2.3的乳酸-乳酸钠缓冲溶液稀释一定倍数的酶液,使之搅拌均匀,静置一段时间,同时称取一定量的壳聚糖使之溶解在5%的HAc溶液中,并加入一定量的3% CaCl2溶液,在37℃水浴中充分混匀。用无菌的5号注射器将含有酶液的海藻酸钠溶液以3滴/s的速度滴加到一定量的壳聚糖醋酸溶液与CaCl2混合溶液中,凝固2min,再加入一定浓度的戊二醛溶液,搅拌1.5h后,放在4℃冰箱中交联一段时间。用蒸馏水洗涤,然后进行冷冻干燥,即可得到固定化胃蛋白酶。

1.2.2 单因素实验 游离酶添加量稀释10倍,海藻酸钠浓度为2%,壳聚糖浓度为2%,CaCl2浓度为3%,固定化时间2h,控制4因素不变,变化1个因素,游离酶添加量稀释倍数5～25倍,海藻酸钠浓度1%～5%,壳聚糖浓度1%～5%,CaCl2浓度2%～6%,固定化时间1～5h,来确定各因素对固定化效果的影响。

1.2.3 响应面实验设计 在单因素的基础上,确定各因素的最佳水平值范围,采用Design Expert 8.06软件进行响应面中心组合实验设计,研究各固定化影响因素对固定化酶活力回收率的影响规律,并得到固定化胃蛋白酶的最佳条件。

以游离酶添加量(A)、海藻酸钠浓度(B)、壳聚糖浓度(C)、氯化钙浓度(D)、交联时间(E)为自变量,固定化酶酶活回收率(R1)为响应值设计响应面实验。自变量水平编码见表1。

表1 实验因素水平编码表

1.2.4 游离蛋白酶与固定胃蛋白酶活力的测定 胃蛋白酶酶活力采用福林-酚法测定蛋白酶活力,即国家标准SB/T13017-1999,固定化酶活力单位为U/g。

1.2.5 固定化酶活回收率的计算方法 固定化酶活性回收率(%)=(固定化酶活力/固定化前游离酶的活力)×100

1.2.6 固定化酶的性质研究

1.2.6.1 固定化酶和游离酶的热稳定比较 取一定量的固定化酶和游离酶,在不同的温度下(17、27、37、47、57、67和77℃)测定游离酶与固定化酶的活力。

1.2.6.2 pH对固定化酶和游离酶酶活力的影响 取一定量的固定化酶和游离酶,分别在pH1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 和4.0条件下测定固定化酶和游离酶的活力。

2 结果与讨论

2.1酪氨酸标准曲线的绘制

按1.2.2福林-酚法,由测得数据绘制酪氨酸标准曲线,标准方程为Y=0.0069X+0.0068,R2=0.9995。

图1 酪氨酸标准曲线

2.2固定化胃蛋白酶条件对固定化蛋白酶活力的影响

2.2.1 游离酶的稀释倍数对固定化酶活力的影响 由图2 可以看出,在稀释5～20倍之间,随着游离酶稀释倍数的增加,固定化酶回收率缓慢增加,可能是由于当稀释倍数较低时,相对游离酶浓度较大,载体上蛋白结合点达到饱和,酶分子之间相互聚焦,造成了酶活性中心结构发生改变,所以导致固定化酶回收率相对较低,而随着稀释倍数的增加,固定化酶回收率直线下降,主要是由于此时开始载体上的蛋白质结合点未达到饱和,所以固定化酶回收率降低[8]。

图2 游离酶的稀释倍数对固定化胃蛋白酶活力的影响

2.2.2 海藻酸钠浓度对固定化酶活力的影响 由图3可以看出,当海藻酸钠浓度为3%时,固定化酶回收率最高。在制备固定化酶时,明显看到,海藻酸钠浓度是直接影响固定化酶成球的主要因素。当海藻酸钠浓度低于3%时,固定化酶微球表面形成的固定化膜强度不够,导致球型不饱满,微球的凝胶孔径较大,酶液容易流失,所以酶活较低；随着海藻酸钠浓度增大,固定化酶微球型比较饱满结实,但由于粘度的增大,制得的固定化酶容易出现拖尾现象,微球的凝胶孔径也随之变小,影响了酶与底物的结合,因此最适的海藻酸钠浓度为3%。

图3 海藻酸钠浓度对固定化胃蛋白酶活力的影响

2.2.3 壳聚糖浓度对固定化酶活力的影响 由图4 可以看出,壳聚糖浓度为3%时,固定化酶回收率最高。当壳聚糖浓度大于3%时,固定化酶回收率开始下降,原因是过大的壳聚糖浓度,使得微胶囊表面的聚电解质膜,更加致密,造成底物扩散困难、固定化酶活力回收降低,而且壳聚糖浓度过高形成的胶囊不易洗涤分离[7]。所以壳聚糖的浓度应该选择在3%。

图4 壳聚糖浓度对固定化胃蛋白酶活力的影响

2.2.4 钙离子浓度对固定化酶活力的影响 CaCl2与海藻酸钠反应形成海藻酸钙凝胶是固定化酶的重要过程,CaCl2质量分数对形成凝胶的机械强度有重要影响[8]。由图5可以看出,低于3%时,随着钙离子浓度增大,酶活力回收率逐渐增大；当大于3%时,随着钙离子浓度的增大,固定化酶回收率逐渐下降。主要原因是当钙离子浓度增大时,较多的钙离子会附着在固定酶微球的凝胶表面,影响了固定化酶的活力。

图5 钙离子浓度对固定化胃蛋白酶活力的影响

2.2.5 交联时间对固定化酶活力的影响 由图6可知,交联时间为4h时,固定化酶活力回收率较高,固化时间在1～4h范围内,由于海藻酸钠-壳聚糖包埋逐渐紧密,酶流失量减小,固定化酶活力回收率逐渐增加；但当时间超过4h后,回收率逐渐降低,原因在于固定化时间过长,海藻酸钠钙结构过于致密,底物的扩散阻力增加[9],酶活力降低,所以选用4h为最佳固定化时间。

图6 交联时间对固定化胃蛋白酶活力的影响

通过单因素实验结果,采用Design Expert8.06响应面设计,以交联时间(A)、海藻酸钠浓度(B)、游离酶稀释倍数(C)、氯化钙浓度(D)、壳聚糖浓度(E)为自变量,固定化酶酶活回收率(R1)为响应面值设计响应面实验。实验设计方案与结果见表2。

利用 Design Expert 8.06软件对实验结果进行方差分析,结果见表3(p值<0.05 为显著项)通过对实验数据进行多元回归拟合,得到酶活回收率(R1)对交联时间(A)、海藻酸钠浓度(B)、游离酶稀释倍数(C)、氯化钙浓度(D)、壳聚糖浓度(E)的回归方程为:

R1=74.46-0.48A-0.35B+0.55C-0.034D-0.32E+0.97AB-0.26AC+1.65AD+0.59AE+2.40BC-2.29BD-0.19BE+1.37CD+0.16CE+0.15DE-0.63A2-1.81B2-0.42C2-1.67D2-0.57E2

表2 响应面实验方案及结果

表3 方差分析结果

应用Design Expert 8.06进行响应面优化分析方法对回归模型进行分析,得到最优响应面结果为交联时间4h,海藻酸钠浓度为3.40%,游离酶稀释倍数为20倍,钙离子浓度为3.64%,壳聚糖浓度为3.39%,固定化酶活回收率为74.87%±1.07%。

各两因素交互作用(显著项)对固定化酶活回收率影响的响应面图见图7。

图7 各两因素交互作用影响(显著项) 对固定化效果影响的响应面图

固定C、D、E三因素到零水平,交联时间(A)和海藻酸钠浓度(B)有显著交互作用,由图7知,在不同海藻酸钠浓度条件下,在一定范围内,随着交联时间增大,固定化酶回收率减小；在不同交联时间的条件下,在一定范围内,随着海藻酸钠浓度的增加,固定化酶回收率先增加后减小。

气象灾害来临之际，因气象部门或地方政府错误估计了灾害天气的严重程度，或者没有做好灾害防御工作，灾后救援工作不及时等，最后导致防灾减灾工作没有达到预期效果，严重威胁到了社会公共安全和人民群众的生命财产安全。

固定B、C、E三因素到零水平,交联时间(A)和钙离子浓度(D)有显著交互作用,由图7知,在不同钙离子浓度条件下,在一定范围内,随着交联时间增大,固定化酶回收率减小；在不同交联时间的条件下,在一定范围内,随着钙离子浓度的增加,固定化酶回收率减小。

固定B、C、D三因素到零水平,交联时间(A)和壳聚糖浓度(E)有显著交互作用,由图7知,在不同壳聚糖浓度条件下,在一定范围内,随着交联时间增大,固定化酶回收率先保持不变后减小；在不同交联时间的条件下,在一定范围内,随着壳聚糖浓度的增加,固定化酶回收率先不变后减小。

固定A、D、E三因素到零水平,海藻酸钠浓度(B)和游离酶稀释倍数(C)有显著交互作用,由图7知,在不同游离酶稀释倍数条件下,在一定范围内,随着海藻酸钠浓度增大,固定化酶回收率先增大后减小；在不同海藻酸钠浓度的条件下,在一定范围内,随着游离酶稀释倍数的增加,固定化酶回收率先增大减小。

固定A、C、E三因素到零水平,海藻酸钠浓度(B)和钙离子浓度(D)有显著交互作用,由图7知,在不同钙离子浓度条件下,在一定范围内,随着海藻酸钠增大,固定化酶回收率先增大后减小；在不同海藻酸钠的条件下,在一定范围内,随着钙离子浓度的增加,固定化酶回收率先增大后保持不变。

固定A、B、E三因素到零水平,游离酶稀释倍数(C)和钙离子浓度(D)有显著交互作用,由图7知,在不同钙离子浓度条件下,在一定范围内,随着游离酶稀释倍数的增大,固定化酶回收率逐渐减小；在不同游离酶稀释倍数的条件下,在一定范围内,随着钙离子浓度的增加,固定化酶回收率先保持不变后减小。

2.3验证实验

在响应面分析法求得的最佳条件下,即交联时间4h,海藻酸钠浓度为3.40%,游离酶稀释倍数为20倍,钙离子浓度为3.64%,壳聚糖浓度为3.39%,进行平行实验(3次),3次平行实验的平均值为75.02%。响应值的实验值与回归方程预测值吻合良好,说明该模型能够较好地预测实际固定化效果。

2.4.1 固定化酶和游离酶的热稳定比较 结果如图8所示,游离酶的最适温度为37℃,固定化酶的最适温度为47℃,可见固定化后酶的耐热性有所提高。结果表明酶经固定化后最适温度有所提高,可能由于固定化过程中酶的结构发生了变化,同时载体对酶也有一定保护作用[10]。

图8 不同温度时游离酶和固定化酶的相对酶活力

2.4.2 pH对固定化酶和游离酶酶活力的影响 由图9可知,当pH为2.0时,游离酶达到最适pH,而固定化酶的最适pH为3.5,表明固定化后的胃蛋白酶的最适pH适应范围更加宽泛。

图9 不同pH时游离酶和固定化酶的相对酶活力

2.4.3 固定化胃蛋白酶的操作稳定性 由于固定化酶可以重复使用,所以测定相同条件下,重复使用5次后固定化酶的相对酶活力,以第一次测得的酶活力为100%,结果如图10。

图10 固定化酶的操作稳定性

由图10结果可知,重复5次以后,酶活力降为原来的 62.3%,相对活力的下降可能是由于在不断搅拌的作用下,海藻酸钠-壳聚糖载体持水性发生变化,酶的作用点随着水解酪蛋白的不断进行而逐渐暴露,以及固定化酶凝胶结构的改变所造成的结果。

3 结论

研究表明,海藻酸钠-壳聚糖作为载体固定化胃蛋白酶的方法,具有工艺简单、条件温和及操作简便的特点,且固定化作用的效果很好。得到的最佳固定化条件为：游离酶稀释倍数为20倍,海藻酸钠浓度为3.40%,壳聚糖浓度为3.39%,钙离子浓度3.64%,时间为4h,固定化酶回收率74.87%,此种方法固定的胃蛋白酶的最适温度为47℃,比游离酶升高了10℃；最适pH 为3.5与游离酶相比pH向碱性偏移1.5,固定化酶活力回收率为 74.87%；经 5次循环重复使用后,固定化酶活力降为原来的62.31%,说明壳聚糖-海藻酸钠作为载体固定的胃蛋白酶的稳定性比较好。

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The study of pepsin immobilized with alginate and chitosa

LIXiao-jing1,HOUJun-cai1,*,JIANGLian-zhou1,ZHUXiu-qing2,HANZong-yuan1,WUYao1,ZHANGJia-xiu1,GAOMeng-ni1,HANWei-wei1,CAOQiu-ge1,GENGHao1

(1. College of Food Science,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China; 2. National Research Soybean Engineering and Technology Center,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

The pepsin was immobilized with the alginate and chitosan to crosslink. The enzymatic properties of the immobilized and free pepsin were studied to get the optimal parameters. The results showed that the optimal immobilization conditions were:the concentration of sodium alginate 3.40%,concentration of chitosan sugar 3.39%,concentration of CaCl23.64%,dilution fold of the free enzyme 20-fold,crosslinking time 4h,respectively. The recovery of the immobilized enzyme could reach 74.87%±1.07% at the optimum temperature of the immobilized enzyme 47℃ and optimum pH3.5,which obtained the operational and thermodynamic stability of the immobilized enzyme stability well. In addition,the immobilized enzyme activity after repeated use five times could still be maintained more than 62%.

alginat;chitosan;pepsin;immobilized enzyme

2013-06-25 *通讯联系人

李晓静(1987-),女,在读硕士研究生,研究方向：食品科学与工程。

“十二五”农村领域国家科技计划课题项目(2012BAD34B04)资助。

TS201.1

：A

：1002-0306(2014)01-0168-06