桶装胀罐番茄酱中腐败菌分离纯化及鉴定研究

,, , ，*，

(1.石河子大学食品学院,新疆石河子 832000； 2.新疆冠农果茸集团股份有限公司技术中心，新疆库尔勒市 841000)

桶装胀罐番茄酱中腐败菌分离纯化及鉴定研究

杨红红1,陈国刚1,刘娅1,江英1，*，王陈强2

(1.石河子大学食品学院,新疆石河子 832000； 2.新疆冠农果茸集团股份有限公司技术中心，新疆库尔勒市 841000)

从胀罐番茄酱中分离出12株菌,并对这12株菌进行传统形态学、生理生化特性鉴定,得出在这12株菌株中有4株芽孢杆菌,3株酵母菌,3株链球菌,2株霉菌。经过反证实验得出导致番茄酱胀袋的主要微生物是芽孢杆菌,酵母菌和霉菌,并通过16S rDNA序列分析及构建系统发育树对优势菌群芽孢杆菌鉴定为4个种,分别为:枯草芽孢杆菌,短小芽孢杆菌,凝结芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌。确定了导致桶装番茄酱胀袋的腐败菌。

番茄酱,腐败,分离,16S rDNA序列分析

番茄酱是鲜番茄的酱状浓缩制品。具有番茄的特有风味,是一种富有特色的调味品,一般不直接入口。常用作鱼、肉等食物的烹饪佐料,是增色、添酸、助鲜、郁香的调味佳品。番茄产业是新疆农产品加工中的支柱产业,然而近年来由于番茄酱滞销,大包装产品基本在露天储存,经过不同季节及不同温度的影响以及野蛮装卸等因素,造成产品质量变质、胀桶漏酱、瘪桶、锈蚀等现象,其中微生物引起的腐败变质便是其中重要的问题之一,产生产品胀袋和平酸腐败,严重影响了我国番茄酱的出口效益[1-2]。P.villari等研究了贮藏过程中,桶装浓缩番茄酱中微生物的群落(包括酵母菌、乳酸杆菌和霉菌)的变化情况,及对番茄酱品质的影响[3]；B.J.O.Efiuvwewwere等分析了尼日利亚市场上销售的三种番茄酱中的微生物构成,分离出了四种主要的微生物菌群(即杆菌属、梭状芽孢杆菌属、乳酸杆菌和明串珠菌属)[4]。国内现有的标准中仅限于罐头食品的商业无菌、霉菌的镜检计数及主要腐败微生物的检测(芽孢杆菌和葡萄球菌)。其中新疆进出口检验检疫局对番茄酱中细菌总数、大肠菌群、厌氧菌和平酸菌、乳酸菌、酵母菌和霉菌的检测方法进行了探索和研究,建立了一套检测番茄酱中几种主要微生物的科学方法[5]。本文针对近年来困扰新疆番茄酱出口企业的大桶番茄酱腐败胀罐现象,通过微生物分离、纯化及分子生物学技术,从腐败变质角度探究导致大桶番茄酱胀罐的微生物本质。本文对已经腐败变质的番茄酱进行了微生物分离与鉴定,并通过16S rDNA 序列分析及构建系统发育树将腐败番茄酱中的优势菌群芽孢杆菌鉴定为种,以期为大桶番茄酱的防腐保藏措施的实施提供理论指导。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

番茄酱 由新疆胡阳河番茄制品有限公司提供,包括正常的桶装番茄酱、已胀袋番茄酱、疑似胀袋番茄酱Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ。番茄酱加工过程中的含盐量为2.5%～3%,酸度0.5%～1.2%(以醋酸计),经过阿氏杀菌(110～115℃)、冷却到(35～37℃)后进行灌装,包装形式为无菌袋装桶,贮藏条件在38℃以下,胀袋和疑似胀袋的番茄酱是在55℃保温5～7d后产生了胀袋现象。Ⅰ和Ⅱ色泽酱红,气味和滋味正常；Ⅲ色泽酱黑粘稠,有酸腐味,开袋时有气体排出,Ⅳ色泽酱红偏黑,滋味有酸味,开袋时发现有少量的气体排出,将Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ三种酱置于55℃恒温箱保温10d,置于4℃冰箱备用,其代号分别为ⅡA、ⅢA、ⅣA,保温后酱体颜色均变深,呈褐红黑色,气滋味同保温前；正向引物27f(对应于Escherichiacoil8-27位碱基)：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′、反向引物1495r(对应于Escherichiacoil1495-1515位碱基)：5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′[6]上海桑尼生物科技有限公司；蛋白胨、酵母膏、琼脂等国产生化试剂；分离纯化培养基 NA培养基、LB 培养基、改良BCP培养基、PDA培养基；生化培养基 淀粉培养基、蛋白胨水培养基[7]。

AUY1200分析天平 上海精密科学仪器有限公司；DKZ-1型电热恒温振荡水槽 上海精宏实验设备有限公司；KDC-1042低速离心机 科大创新有限公司；XMTB数显温控仪 余姚市东方电工仪器厂；ZHJH-C1115C智能型安全超净工作台 上海智诚分析仪器制造有限公司；OLYMPUS CHC生物显微镜 日本Olympus 公司；TD5A-WS台式低速离心机 长沙湘仪离心仪器有限公司；JY04S凝胶成像仪 北京君意东方电泳设备有限公司；050-810PCR扩增仪 Tgradient 48 Biometra Tgradient。

1.2实验方法

1.2.1 密封性检验 将被检密封袋先浸入温水中预热,再置于86℃水浴中,让密封袋沉入水面以下5cm,然后观察5min,若发现有小气泡连续上升者,表明漏气[8]。

1.2.2 内容物增菌 样袋洗净、揉捏混匀、超净工作台紫外灯下照射30min,在无菌环境下用75%的酒精擦拭开口及周围10cm范围。然后用无菌小针扎几个小孔(同时用倒置的无菌试管采集袋内气体,在酒精灯火焰旁试燃,检验气体是否是氢气),让袋内气体缓慢排除,避免喷涌现象。然后用灭过菌的剪刀开口,分别取变质和正常的番茄酱内容物各25g,于225mL的生理盐水中振荡均匀后,再用吸管各吸取1mL菌悬液转入10mL液体培养液中,于28、37、55℃三种温度下连续培养4d,每隔24h记录一次。

1.2.3 分离纯化

1.2.3.1 芽孢杆菌的分离及纯化 将样品摇匀,各取1mL样品放入灭过菌的1.5mL的EP管中,90℃沸水浴10min,然后吸取200μL以无菌涂菌棒分别涂布于营养肉汤琼脂平板上,于37℃培养箱中培养48～72h至长出单个菌落。再根据芽孢杆菌菌落形态特征,选取菌落形态明显不同的几种菌落,用无菌接种环分别于NA培养基平板上划线培养,直到长出单个菌落。再分别挑取单个菌落然后划线到LB斜面上,活化3代后,置于4℃冰箱保存备用。

1.2.3.2 其他菌的分离纯化 将样品摇匀,然后吸取200μL以无菌涂菌棒分别涂布于改良BCP培养基、PDA培养基进行28、37、55℃三种温度条件进行分离培养,连续培养4d,每24h观察记录一次[6],将培养后长出的单个菌落分别挑取少许细胞划线到对应的培养基上,分别置28、37、55℃培养箱培养,大菌苔长出后,检查其特征是否一致,同时将细胞涂片染色后用显微镜检查是否为单一的微生物。若发现有杂菌,需要再一次进行分离纯化,直到获得纯培养,接种到相应斜面培养基,于相应最适温度培养,置于4℃冰箱保存备用保存。

1.2.4 鉴定方法 本实验通过参考常见细菌鉴定手册、伯杰细菌鉴定手册[9-10]等微生物鉴定书籍采取菌落观察、革兰氏染色、芽孢染色并根据各菌株生理生化特性、生长特征等进行菌株的鉴定。

1.2.5 反证实验 将分离出的菌株反接种到正常的番茄酱中,每一菌株同时接种两批,进行平行实验,每批12个样袋,接种后进行密封,每隔3d进行采样共培养15d,观察是否有胀袋、异味和变色现象[11],取变质的番茄酱进行微生物的检测并和正常番茄酱中分离出的微生物进行比较,确定导致番茄酱的主要致腐菌。

1.2.6 分子生物学鉴定 将纯化好的菌株接种于5mL无菌MRS液体培养基中,置37℃培养18～24h,基因组DNA提取参考文献[12]方法。PCR扩增条件：94℃预变性5min;94℃变性1min,58℃退火1min,72℃延伸2min,30个循环;72℃末端延伸10min 4℃保存。反应体系为50μL：10×E×Taq buffer 5μL,MgCl2(25mmol/L)4μL,dNTP MIX(2.5mmol/L each)4μL,引物27f(10pmol/mL)2μL,引物1495r(10pmol/μL)2μL,基因组DNA模板(100ng/μL)2μL,TaKaRa ExTaq酶(5U/μL)0.6μL,用ddH2O定容至50μL,扩增反应完毕后,取2μL的PCR产物与2μL 6×Loading buffer混合,加样于1%琼脂糖凝胶点样孔中进行电泳,如果PCR成功,则在约为1500bp处可见到清晰的条带,纯化后送上海桑尼生物技术有限公司进行序列测定。

得到的序列运用软件拼接校准排齐后在NCBI数据库进行BLAST(Basic LocalAlignment Search Tool)(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)同源性比对,并利用软件中的cluster W构建系统发育树,以同源性大于99%为种的分界阈值将待测菌株鉴定到种[13],确定优势腐败菌。

2 结果与讨论

2.1增菌前检测及增菌结果与分析

袋装番茄酱密封性检测结果表明实验所用密封袋密封性良好,放入水中并未产生气泡,无菌试管采集袋内气体,在酒精灯火焰旁试燃,没有火焰产生,证明不是氢气。

表2 桶装番茄酱中腐败微生物的菌落个体形态观察

表3 桶装番茄酱腐败菌生理生化实验结果

内容物出现褐变、浑浊、粘稠的现象,导致番茄酱出现这种现象的原因有化学因素和物理因素,比如番茄酱本身就有某些氧化酶使得番茄酱的颜色呈褐色而不是鲜艳的番茄本身颜色;番茄酱在贮藏过程中不同温度和人为的野蛮装卸对番茄酱品质都有一定影响,而微生物是导致大桶番茄酱发生质变的主要原因[14]。

2.2桶装番茄酱腐败微生物的分离

本实验经分离纯化得到51株菌株,在NA培养基、改良BCP培养基、PDA培养基中生长情况见表1。

表1 桶装番茄酱腐败微生物在不同培养基上的分离纯化

由表1可知,从正常、疑似胀袋和胀袋番茄酱中总共分离出了51株菌,其中包括不产芽孢菌、芽孢杆菌、霉菌和酵母菌,将菌落形态一样的,并且在同一种培养基上培养的菌株筛选出来,进行革兰氏和芽孢染色发现有同种菌株,其中芽孢杆菌为31株,不产芽孢菌为6株,霉菌、酵母菌为14株,可以看出在番茄酱中芽孢杆菌为优势菌群。经过重复筛选后,选出12株不同的菌株进行微生物形态学和生理生化的鉴定。

2.3桶装番茄酱腐败微生物的鉴定

2.3.1 桶装番茄酱腐败微生物的形态学鉴定 从表2可以看出,9和10菌落大而厚,菌落表面光滑、湿润、粘稠,容易挑起,菌落质地均匀,正反面和边缘、中央部位的颜色都很均一,是同类菌,11和12参照霉菌鉴定手册中霉菌的形态描述及检索表,分别确定为：葡萄状穗霉属和灰绿曲霉。

2.3.2 生理生化实验 为了进一步确定纯化菌株的具体种类,进行了一部分生理生化实验,实验结果见表3。

由表3和表4可得出,1、2、3、4为芽孢杆菌属,5、6、7、8为大肠埃希氏菌和棒杆菌属；根据形态学和生理生化鉴定得出9、10菌株为季也蒙假丝酵母和季氏毕赤氏酵母。

2.3.3 反证实验结果 将分离出的12株菌反接种到正常的番茄酱中,每3d采样观察,取样之前观察番茄酱是否有胀袋现象,取出样品后观察是否有异味和变色现象,如果发生变质就取0.1g番茄酱进行微生物的检测,并与正常番茄酱中分离出的微生物进行比较,确定导致番茄酱胀袋的微生物,反证实验结果见表4。

由表4可见,将12种菌株接种到番茄酱中,其品质有一定改变,接种后的第7d,番茄酱品质有明显的变化,出现了不同程度的胀袋、变色和异味,第15d番茄酱的胀袋、变色和异味现象趋于稳定,将接种后发生变质的番茄酱取0.1g进行微生物检测后,同正常番茄酱中分离出的微生物进行比较发现,接种对应菌株的数量大于正常番茄酱中该菌株的数量,由表4也可以看出1、2、3、4号主要的污染菌是芽孢杆菌,接种后异味、变色的现象都有发生,9和10号主要的产气菌是酵母菌,而且产气最明显的是在3～7d中。由表4还可以看出,11、12号菌株接种到番茄酱中会引起番茄酱变色,可知霉菌会引起番茄酱色泽的变化,将胀袋中分离出的微生物与正常番茄酱中微生物进行比较,发现腐败番茄酱中分离出的芽孢杆菌在菌群中所占比例最大,是腐败番茄酱中的优势菌群。

表4 桶装番茄酱腐败微生物反证实验结果

注:+生长；++生长良好;0 不生长。

2.3.3 分子生物学鉴定 主要致腐菌的16rDNA序列分析及系统发育树构建见图1。

图1 分离自胀袋番茄酱中芽孢杆菌的 16S rDNA系统发育树

由图1可以看出：Y1和枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)位于同一分支,且这株菌的16S rDNA序列与Bacillussubtilis同源性均达到了99%,所以这株菌归为Bacillussubtilis；Y2和短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)在一个分支上,结合16S rDNA序列同源性结果鉴定Y2为Bacilluspumilus；Y4的16S rDNA的序列与蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)AB680147的同源性达到99%,系统发育树显示它们与BacilluscereusAB680147在同一分支上,所以将Y4鉴定为Bacilluscereus；Y3和凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)处在同一分支,而其16S rDNA序列同源性结果达到了99%,故将其鉴定为Bacilluscoagulans,由系统进化树可以看出短小芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的亲缘关系较近,和凝结芽孢杆菌菌种之间亲缘关系相对较远。

3 讨论

传统的微生物鉴定方法虽然经过了很长时间的发展,已经比较完善,但是由于鉴定步骤繁多,很多反应是生物体的自然生理过程,耗时长,整个鉴定过程很缓慢;而且,很多性状都是基于感官来判断的,主观的干扰很容易被引入,不能正确地反映微生态,分类不够准确和科学。而以16S rDNA为基础的现代分子生物学技术克服了传统鉴定和分类方法的局限性,而且提高了解析的灵敏度,在基因水平上扩大了物种多样性的视野,可以快速、微量、准确简便的对微生物进行分类鉴定[15]。

以上鉴定结果可以看出,芽孢杆菌属是腐败番茄酱中的优势菌群,在反证实验当中芽孢杆菌是引起变质的主要菌群,本实验对胀袋番茄酱中致腐微生物进行了传统微生物鉴定和16S rDNA分子序列测序进一步确定了腐败番茄酱中的优势菌并将芽孢杆菌鉴定到种,构建了系统发育树,明确了芽孢杆菌种之间的亲缘关系,为大桶番茄酱的防腐措施提供了一定的理论指导。

4 结论

4.1 本实验通过对番茄酱中腐败微生物的分离纯化得到12株菌,通过形态学鉴定和生理生化实验确定从番茄酱中分离出的12株菌株有4株是芽孢杆菌,2株为大肠埃希氏菌和2株为棒杆菌属,3株酵母菌,2株霉菌,其中芽孢杆菌是短小芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌,酵母菌是季氏毕赤氏酵母、季也蒙假丝酵母,霉菌是葡萄状穗霉属、灰绿曲霉。

4.2 通过反证实验确定导致番茄酱胀袋的腐败菌,结合传统微生物鉴定和16S rDNA序列测定,确定腐败番茄酱中的优势菌群为芽孢杆菌。并进行了芽孢杆菌的系统发育树的构建,将4株芽孢杆菌鉴定到种,通过对系统发育树的观察确定了短小芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的亲缘关系较近,和凝结芽孢杆菌菌种之间亲缘关系相对较远。

[1]闫国宏.论新疆加工番茄酱产业的发展[J].罐藏食品,2007,63(1):24-31.

[2]张军,朱磊.新疆番茄加工业的国际竞争力分析[J].新疆财经,2001(3)：13-19.

[3]P.Villarietal.Lactobacillus fructivorans spoilage of tomato ketchup[J].food prot,1997,60(5):505-509.

[4]BJO.Efiuvwevwereetal. Microbiological profile and potential hazards associated with imported and local brands of tomato paste in Nigeria[J]. Journal of Applied Microbiology,1998,84：409-416.

[5]黄忠梅,黄玲.番茄酱中厌氧菌/兼性厌氧菌的鉴定结果分析[J].新疆农业科学，2007,44(5):654-657.

[6]Jensen MA,Webster JA,Strauss N,etal. Rapid identification of bacteria on the basis of polymerase chain reaction-amplifiedribosomal DNA spacer polymorphisms[J]. Appl Environ Microbial,1993,59:943-952.

[7]GB/T4789126-2003食品卫生微生物学检验罐头食品商业无菌的检验[S].2003.

[8]赵贵明主编.食品微生物实验室工作指南[M].北京：中国标准出版社,2005.

[9]R E 布坎南,N E 吉本斯.伯杰细菌鉴定手册(第8版)[M].北京:科学出版社,1984.

[10]东秀珠. 常见细菌系统鉴定手册[M].北京:科学出版社,2001.

[11]丁生林,徐榕蔓.番茄酱产气变质成因分析及控制要点[J].食品与发酵工业,2010,36(9):90-93.

[12]Walker WH,Fitzpatrick SL,Barrera-Saldana HA,etal. The human placental lactogen genes:structure,function,evolution and transcriptional regulation[J]. Endocr Rev,1991(12):316-318.

[13]Tamura K,Dudley J,Nei M,etal. MEGA4:Molecular Evolutionary Genetics Analysis(MEGA)software version 4.0[J]. Mol Biol Evol,2007(24):1596-1599.

[14]庞胜群,王祯丽,张润,等.新疆加工番茄酱产业现状及发展前景[J].中国蔬菜,2005(2)：39-41.

[15]雷正瑜.16SrDNA序列分析技术在微生物分类鉴定中的应用[J]. 湖北生态工程职业技术学院学报,2006,4(1):4-7.

Study on isolation and identification of the spoilage microbes in bottled tomato sauce and their characteristics

YANGHong-hong1,CHENGuo-gang1,LIUYa1,JIANGYing1,*,WANGChen-qiang2

(1.College of Food,Shihezi University,Shihezi 832000,China; 2.Xinjiang Guannong Fruit & Antler Group Co.,Ltd,korla 841000,China)

A total of 12 strains were separated from metamorphic tomato sauce. It was obtained that there were fourBacillus,three Yeast,threeStreptococcus,two Molds,in these 12 strains by the traditional morphological,physiological and biochemical characteristics. The disprove experimentally indicated that the main microorganism that leaded to bulging bag of tomato sauce wereBacillus,Yeast and Mildew,furthermore through 16S rDNA sequence analysis and phylogenetic tree was constructed on the dominant bacteriaBacillusidentified four kinds,namely:Bacillussubtilis,Bacillupumilus,BacilluscereusandBacilluscoagulanc.Results suggested Spoilage caused the bulging bag of tomato sauce.

tomato sauce;taint;isolated;16S rDNA sequencing analysis

2013-07-01 *通讯联系人

杨红红(1989-)，女，硕士研究生，研究方向:果蔬加工与贮藏。

自然基金项目(31260388);兵团科技攻关计划(2012BA013)。

TS201.3

：B

：1002-0306(2014)01-0164-05