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葛畅 许春伟 王鲁平 方园 张玉萍

[摘要] 目的 探讨甲基化酶抑制剂5'-氮杂-2'-脱氧胞苷（5'-Aza-2'-deoxycytidine，5'-Aza-CdR）对结直肠癌细胞株HT-29和LoVo中Wif-1基因甲基化水平及蛋白表达的影响。 方法 用不同浓度（0.5、1.0、1.5 μmol/L）5'-Aza-CdR处理结直肠癌细胞株HT-29和LoVo。应用TaqMan探针为基础的实时定量PCR（Methylight）方法、SYBR Green PCR方法及蛋白印迹实验（Western blot）检测药物处理前后HT-29和LoVo细胞中Wif-1基因的甲基化状态、mRNA和蛋白表达。 结果 Methylight检测HT-29和LoVo细胞中Wif-1蛋白在药物作用后异常甲基化得到逆转；实时荧光定量PCR和Western Blot检测到0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR处理后Wif-1基因mRNA和蛋白重新表达，实时荧光定量PCR检测DMSO对照组和不同浓度5'-Aza-CdR（0.5、1.0、1.5 μmol/L）在HT-29细胞株相对表达量分别为（1.000±0.000）、（1.207±0.052）、（1.790±0.033）和（2.016±0.123）；在LoVo细胞株相对表达量分别为（1.000±0.000）、（1.294±0.048）、（1.893±0.061）和（2.204±0.041）。Western blot检测Wif-1蛋白检测DMSO对照组和不同浓度5'-Aza-CdR在HT-29细胞株相对表达量分别为（0.456±0.040）、（0.511±0.025）、（0.857±0.031）和（0.934±0.047）；LoVo细胞株相对表达量分别为（0.842±0.032）、（0.844±0.044）、（0.854±0.037）和（0.856±0.034）。以上作用均呈时间、剂量依赖性，Wif-1基因mRNA在HT-29细胞株表达和LoVo细胞株表达差异均有高度统计学意义（F=144.823，P=0.000；F=476.195，P=0.000）。Wif-1蛋白表达在HT-29细胞株表达差异有高度统计学意义（F=129.674，P=0.000），但Wif-1蛋白表达在LoVo细胞株表达差异无统计学意义（F=0.117，P=0.948）。 结论 结直肠癌细胞株HT-29和LoVo中Wif-1启动子甲基化可能是导致该基因表达下调甚至失活的主要原因。5'-Aza-CdR能够较成功地逆转结直肠癌细胞株HT-29和LoVo中Wif-1基因的甲基化状态，并能恢复mRNA及蛋白重新表达。

[关键词] DNA甲基化；5'-Aza-CdR；HT-29；LoVo；Wif-1基因

[中图分类号] R735.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）08（b）-0016-06

Effect of 5-Aza-dC on mRNA expression， protein expression and methylation of Wif-1 gene status in HT-29 and LoVo Colorectal cancer

GE Chang XU Chunwei WANG Luping FANG Yuan ZHANG Yuping

Department of Pathology， the Military General Hospital of Beijing PLA， Beijing 100700， China

[Abstract] Objective To investigate the effects of 5-Aza-2-deoxycytidine （5-Aza-dC）， a methylation inhibitor， on the mRNA expression， protein expression of Wif-1 gene in HT-29 and LoVo Colorectal cancer cell lines. Methods HT-29 and LoVo Colorectal cancer cell lines was treated with different dosages of 5-Aza-dC. Wif-1 gene DNA， mRNA and protein were determined by Methylight， SYBR Green PCR and Western blot respectively. HT-29 and LoVo Colorectal cancer cell lines were treated with different dosages of 5-Aza-dC （0.5， 1.0， 1.5 μmol/L）. Wif-1 gene DNA， mRNA and protein were determined by Methylight， SYBR Green PCR and Western blot respectively. Results Methylight detection showed that the Wif-1 gene methylation had effectively been reverserd by 5-Aza-dC. Moreover， the expression levels of Wif-1 gene mRNA treated with 5-Aza-dC increased respectively in HT-29 Colorectal cell line[（1.000±0.000）， （1.207±0.052）， （1.790±0.033）， （2.016±0.123）]， and the expression levels of Wif-1 gene mRNA treated with 5-Aza-Dc increased respectively in LoVo Colorectal cell line [（1.000±0.000）， （1.294±0.048）， （1.893±0.061）， （2.204±0.041）]. Western blot indicated that 5-Aza-dC could recover the Wif-1 protein expression respectively in HT-29 Colorectal cell line [（0.456±0.040）， （0.511±0.025）， （0.857±0.031）， （0.934±0.047）]， and the protein expression was （0.842±0.032）， （0.844±0.044）， （0.854±0.037）， （0.856±0.034）， respectively in LoVo Colorectal cell line. The Wif-1 gene mRNA effects within certain extent dose and time dependent with statistical significance in HT-29 Colorectal cancer line （F=144.823， P=0.000） and LoVo Colorectal cancer line （F=476.195， P=0.000）， and the Wif-1 protein effects within certain extent dose and time dependent with statistical significance in HT-29 Colorectal cancer line （F=129.674， P=0.000）， but without statistical significance in LoVo Colorectal cancer line （F=0.117， P=0.948）. Conclusion The methylation of promoter region is a main cause for transcriptional inactivation of Wif-1 gene in HT-29 and LoVo Colorectal cancer cell lines. 5-Aza-dC may effectively reactivate the gene transcription through a demethylation role.

[Key words] DNA methylation； 5-Aza-dC； HT-29； LoVo； Wif-1 gene

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）作为最常见恶性肿瘤之一，其发病率仅位于肺癌和前列腺癌（女性为乳腺癌）之后，居第3位，而每年CRC病死率约占全部恶性肿瘤死亡总人数的8%，在恶性肿瘤死因中居第4位[1]。CRC的发生与发展与癌基因和抑癌基因的缺失、扩增或突变有关。有些基因在染色质水平上发生表型遗传修饰改变也会导致表达下调。表型遗传修饰最多见的是CpG岛（CpG island）的甲基化改变。Wif-1基因（Wnt inhibitory factor-1）定位于人类染色体12q14.3上，由10个外显子组成，全长约200 kb。Wnt/β-catenin信号传导通路是调控细胞生长增殖的重要途径之一，其异常激活已发现与多种人类肿瘤密切相关[2]。Wif-1基因是这条通路的下游区基因也是这条通路的拮抗基因。Wif-1基因的高甲基化在多种肿瘤中都已证实是存在的，它作为一种肿瘤抑制基因（tumor suppressor gene，TSG），其启动子的高甲基化参与了肿瘤的发生发展。本实验通过研究5'-氮杂-2'-脱氧胞苷（5'-Aza-CdR）对HT-29和LoVo细胞株作用后Wif-1基因的DNA层面、mRNA层面和蛋白层面的改变，探讨肿瘤发生发展过程中Wif-1基因失活的甲基化机制及药物恢复Wif-1基因表达的可能性，以期寻找CRC的肿瘤标志物及新的治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

结直肠癌细胞株HT-29和LoVo（北京大学医学部107实验室）；DNA提取试剂盒（德国QIAGEN公司）；核酸蛋白质浓度测量仪B-500（上海创萌生物科技有限公司），DNA甲基化修饰试剂盒及甲基化阳性/阴性对照（美国ZYMO公司）；qPCR反应试剂ROX（TaKaRa公司）；Mix（上海辉睿生物科技有限公司）；Mx3000P定量PCR扩增仪（美国Stratagene公司）；引物由生工生物工程（上海）有限公司合成；5'-Aza-CdR（美国Sigma公司），以DMSO溶剂充分溶解后配制成0.1 μmol/L的母液，分装后-80℃保存；Wif-1和内参β-actin（美国Santa Cruz公司），Western blot相关试剂（北京索莱宝科技有限公司）。

1.2 细胞培养和干预

结直肠癌细胞株HT-29和LoVo置于10%胎牛血清和100 μ/mL青霉素、链霉素的RPMI1640的培养基中常规培养，胰酶消化传代。取贴壁生长良好的细胞以RPMI1640调整细胞密度至2×106/mL，接种于六孔培养板。干预的LoVo和HT-29细胞分别加入0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR混合培养液，每24小时更换新鲜培养基，连续作用72 h；以HT-29和LoVo分别加入等量DMSO溶剂培养作为对照（0 μmol/L）。

1.3 Methylight方法

取对数生长期的HT-29和LoVo细胞株，胰酶消化后抽提DNA。抽提DNA按DNA提取试剂盒（德国QIAGEN公司）说明提取上述两种细胞不同浓度梯度的细胞DNA，用紫外分光光度仪（上海创萌生物科技有限公司）测DNA浓度，以DNA浓度在25 ng/μL为最低浓度，使用DNA修饰试剂盒进行亚硫酸氢盐修饰，按照试剂盒说明书操作，Wif-1基因甲基化引物和探针设计：Wif-1基因序列参照GenBank。甲基化引物和探针由Beacon Designer 7.9软件设计，其引物序列上游引物：5'-TAAACGGGAATAGTTTTGGTTGAGG-3'；下游引物：5'- TACTACTCAAAACCTCCTCCTCGCTAC-3'；探针：FAM 5'- CTCCTCGTACCGCACCTACGCAACCTA-3' BHQ1，内参β-actin基因甲基化按文献[3]设计，上游引物：5'-TGGTCATC CAGGTTTAGTAACT-3'，下游引物：5'-AACCAATAAAC CTACTCCTCCCTTAA-3'，探针：FAM 5'-ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA-3'BHQ1。PCR反应总体系为20 μL，2×Taq PCR Master Mix 10 μL；修饰后的DNA模板2 μL；上、下游引物各1 μL（10 pmol）；探针FAM 0.4 μL（10 pmol）；ROX 0.3 μL。反应条件：94℃预变性5 min；94℃ 30 s，52℃ 45 s，72℃ 45 s，共50个循环；72℃延伸5 min，4℃冷却5 min。经亚硫酸氢盐修饰的Human Methylated & Non-methylated DNA Set作为阳性、阴性对照，水为空白对照。

1.4 实时荧光定量PCR分析结直肠癌细胞株HT-29和LoVo中Wif-1基因mRNA的表达情况

取对数生长期的HT-29和LoVo细胞，胰酶消化后抽提细胞总RNA，逆转录合成cDNA，行实时荧光定量PCR。Wif-1引物由Primer Premier 5.0软件设计，上游引物：5'- GTTCCACGGACCTCACT-3'，下游引物：5'-ATGTCGGAGTTCACCAGA-3'；内参基因GAPDH上游引物：5'-GGCTGCTTTTAACTCTGG-3'，下游引物：5'-GGAGGGATCTCGCTCC-3'。20 Μl PCR反应体系含10 μL SYBR Premix Ex TaqTM（2×）、上、下游引物（10 μmol/L）各1、0.3 μL ROX Reference Dye（50×）、4.0 μL DNA模板、3.7 μL dH2O。反应条件为95℃预变性5 min；95℃ 10 s，55℃ 40 s，72℃ 45 s，共40个循环；72℃延伸1 min，70℃延伸30 s，95℃延伸30 s。实验重复3次，取均值。扩增完毕后分析熔解曲线，采用2-ΔΔCt法分析Wif-1 mRNA表达。ΔΔCt=（Ct处理组目的基因-Ct处理组内参基因）-（Ct对照组目的基因-Ct对照组内参基因）。

1.5 Western blot分析结直肠癌细胞株HT-29和LoVo中Wif-1蛋白的表达情况

取对数生长期的HT-29和LoVo细胞，在上述两种细胞株各个浓度梯度的每管细胞中加入80 μL蛋白裂解和1 μL蛋白酶抑制剂PMSF液于冰上裂解30 min。15 000 r/min 37℃离心，10 min后取上清液提取总蛋白，BCA法蛋白定量。总蛋白100℃变性5 min后，配制浓度为12%的SDS-PAGE凝胶，进行蛋白质电泳，蛋白电泳分离后经电转移槽转移至PVDF膜。BSA室温封闭2 h后，PVDF膜置于1∶200稀释的Wif-1单克隆抗体稀释液中4℃冰箱内培养过夜，TBST洗膜3次，每次10 min，再置于1∶20 000稀释的HRP标记的山羊抗兔IgG稀释液中37℃培养2 h，TBST洗膜4次，每次10 min，然后加入ECL发光液显影，采集并分析处理图像。凝胶成像系统摄像并分析各条带吸光度值，以0.5 μmol/L 5'-Aza-CdR条带吸光度值（A）/β-actin条带吸光度值（A）为基准，设置为1。以目的基因条带吸光度值（A）/β-actin条带吸光度值（A）作为Wif-1蛋白的相对表达强度。实验重复3次，取其平均值。

1.6 MethyLight结果判断标准

同时扩增目的基因（Wif-1）和内参基因（β-actin），根据标准曲线得到两者的原始拷贝数，计算标准甲基化指数（the normalized index of methylation，NIM）。其定义为：NIM=[（Wif-1 sample/Wif-1 positive）/（β-actin sample/β-actin positive）]×100，其中Wif-1 sample指样本中甲基化Wif-1基因的拷贝数，Wif-1 positive指阳性对照中甲基化Wif-1基因的拷贝数，β-actin sample指样本中甲基化Wif-1基因的拷贝数，β-actin positve指阳性对照中甲基化Wif-1基因的拷贝数。NIM≥4为甲基化，NIM<4为非甲基化[4]。

1.7 统计学方法

采用统计软件SPSS 19.0对实验数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），行配对t检验，并设定P值为双侧分布，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结直肠癌细胞株HT-29和LoVo中Wif-1基因甲基化状况

将阳性对照按10的倍数稀释成1×100～1×10-6 7个浓度梯度制作标准曲线（其拷贝数为103～109/mL）。各浓度梯度反应均做复孔。MethyLight的线性范围为104～108拷贝/mL，R2为0.907。实时荧光定量PCR得出数据按MethyLight结果判断标准，在DMSO对照组、0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR中HT-29和LoVo细胞株中Wif-1基因甲基化状态分别为甲基化、甲基化、未甲基化和未甲基化。见表1、图1。

表1 HT-29和LoVo细胞株中Wif-1基因甲基化状况

2.2 结直肠癌细胞株LoVo和HT-29中Wif-1基因mRNA表达状况

实时荧光定量PCR得出的数据检验扩增效率（E）通过公式E=2-1/斜率-1计算，Wif-1基因mRNA为0.945，GAPDH基因mRNA为0.977，两个基因的扩增效率相差<5%，符合用2-ΔΔCt法相对定量分析条件。经2-ΔΔCt法分析并以对照组、各不同浓度实验分组为横坐标，将测出相应的平均相对定量比值为纵坐标，绘出柱状图后发现0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR作用后，HT-29细胞株中Wif-1基因的mRNA表达水平较DMSO对照组上调，并且有时间、药物浓度依赖性（F=144.823，P=0.000），与DMSO对照组比较，0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR差异均有统计学意义（t = 6.945，P = 0.020；t = 41.629，P = 0.001；t = 14.262，P = 0.005）；LoVo细胞株中Wif-1 mRNA表达水平较DMSO对照组上调，并且有时间、药物浓度依赖性（F=476.195，P=0.000），与对照组比较，0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR差异均有高度统计学意义（t = 10.656，P = 0.009；t = 25.486，P = 0.002；t = 51.323，P = 0.000）。见表2、图2。

表2 HT-29和LoVo细胞株中Wif-1基因mRNA表达状况（x±s）

注：与DMSO对照组比较，*P < 0.05，**P < 0.01

2.3结直肠癌细胞株HT-29和LoVo中Wif-1蛋白表达状况

Western blot结果运用Image J软件进行条带图像分析，获得HT-29和LoVo细胞株各条带光密度值，并计算出两种细胞在各组中的平均光密度比值，进行半定量分析及统计学分析，并以各实验分组为横坐标，将测出相应的平均光密度比值为纵坐标，绘出柱状图后发现0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR作用后，HT-29细胞株中Wif-1蛋白表达水平较DMSO对照组上调，并且有药物浓度依赖性（F=129.674，P=0.000），与DMSO对照组比较，1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR组比较，差异均有统计学意义（t=45.825，P=0.000；t=9.584，P=0.011）。LoVo细胞株中Wif-1基因的蛋白表达水平较DMSO对照组略微上调，并且有药物浓度依赖性但差异无统计学意义（F=0.117，P=0.948），与DMSO对照组比较，0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR组差异均有高度统计学意义（t = 19.414，P = 0.003；t = 30.468，P = 0.001；t = 102.233，P = 0.000）。见表3、图3。

表3 HT-29和LoVo细胞株中Wif-1蛋白表达状况（x±s）

注：与DMSO对照组比较，*P < 0.05，**P < 0.01

A：DMSO对照组，0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR组中HT-29细胞株Wif-1蛋白Westernblot条带图；B：DMSO对照组，0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR组中HT-29细胞株Wif-1蛋白柱状图；C：DMSO对照组，0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR组中LoVo细胞株Wif-1蛋白Westernblot条带图；D：DMSO对照组，0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR组中LoVo细胞株Wif-1蛋白柱状图

图3 各组HT-29细胞株及LoVo细胞株Wif-1蛋白表达

3讨论

CRC是最常见的消化道恶性肿瘤之一，每年全球新发病例达123万，病死率约为发病率的1/2。我国CRC发病率虽低于西方发达国家，但近20年来CRC的发病率仍在逐渐上升，同时，其发病年龄有增高趋势。近年研究表明CRC的发病是多因素、多阶段、多基因连续累积发生的过程，除遗传学改变外，表观遗传学改变亦参与CRC的发生、发展过程。表观遗传学是指不涉及DNA序列改变，但基因表达却发生可遗传的改变，DNA甲基化、组蛋白修饰、MicroRNA等是表观遗传学的主要形式。与肿瘤发生关系最密切的是DNA甲基化修饰异常，其中包括基因组去甲基化及部分区域高度甲基化两种形式。DNA甲基化可以导致癌相关基因沉默，病变迅速进展为癌。CRC有若干高度甲基化基因，若能认识CRC中基因异常DNA甲基化，将可能获得CRC诊断的肿瘤标志物及新的治疗靶点[5-7]。

经典Wnt/β-catenin信号通路发现迄今已数十年，作为一条高度保守的信号通路在动物胚胎的器官发育各个阶段均发挥异常重要的作用。Wif-1基因是Wnt/β-catenin信号传导通路的拮抗基因之一，属SFRP拮抗家族，在种族间高度保守，最早在人类视网膜中发现[8]。它主要通过捆绑Wnt信号蛋白，阻止其与Frizzled受体相互作用，从而抑制通路的异常激活。Nosho等[9]的研究发现，在早期CRC中伴有Wif-1表达的下调，可能通过引起经典Wnt/β-catenin信号通路的激活，导致通路下游靶基因的过度表达，伴随细胞过度的增殖和失控的分化从而引起肿瘤的发生。表观遗传学改变如基因5′端CpG岛甲基化是Wif-1基因失活的重要机制。已有一系列研究证实在各系统肿瘤中，启动子区甲基化可引起Wif-1基因失活[10-12]。在CRC中，Taniguchi等[13]和Lee等[14]的研究显示，Wif-1启动子区的甲基化率都很高，分别为82.0%和74%。齐健等[15]的研究结果与国外基本一致，Wif-1甲基化率为84.7%。Wif-1基因的启动子中存在T细胞相关因子（T cell factor，TCF）的反应元件[11]，而TCF是目前已知的Wnt通路中重要的核内靶因子，Wnt信号活化可使β-catenin在胞浆内累积并进入核内识别淋巴结增强因子/T细胞相关因子（lymphoid enhancer factor/T cell factor，LEF/TCF）等转录因子，激活Wnt信号的靶基因，控制胚胎发育及细胞生长、分化及凋亡等。Kansara等[16]和Chung等[17]的研究结果显示，Wnt拮抗物的高甲基化可以增加β-catenin在细胞质中的积聚及经典Wnt/β-catenin信号通路的激活。

本实验研究中笔者采用去甲基化药物5'-Aza-CdR处理两个结直肠癌细胞株：MSS细胞株HT-29和MSI细胞株LoVo后通过实时荧光定量PCR检测，笔者发现DNA层面上DMSO对照组，0.5、1.0、1.5 μmol/L 5′-Aza-dCR中HT-29细胞株中Wif-1基因甲基化状态分别为甲基化、甲基化、未甲基化和未甲基化，LoVo细胞株中Wif-1基因甲基化状态都为未甲基化，说明去甲基化药物5′-Aza-CdR能够逆转Wif-1基因甲基化状态，同时在mRNA层面上笔者发现在0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR作用后，HT-29细胞株中Wif-1基因的mRNA表达水平较DMSO对照组上调，并且有时间、药物浓度依赖性（F=144.823，P=0.000），与DMSO对照组比较，0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR差异均有统计学意义（t=6.945，P=0.020；t=41.629，P=0.001；t=14.262，P=0.005）；LoVo细胞株中Wif-1基因的mRNA表达水平较DMSO对照组上调，并且有时间、药物浓度依赖性（F=476.195，P=0.000），与DMSO对照组比较，0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR差异均有高度统计学意义（t=10.656，P=0.009；t=25.486，P=0.002；t=51.323，P=0.000）。最后通过Western blot在蛋白层面上发现在0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR作用后，HT-29细胞株中Wif-1蛋白表达水平较DMSO对照组上调，并且有时间、药物浓度依赖性（F=129.674，P=0.000），与DMSO对照组比较，1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR组比较，差异均有统计学意义（t=45.825，P=0.000；t=9.584，P=0.011）。LoVo细胞株中Wif-1基因的蛋白表达水平较DMSO对照组略微上调，并且有药物浓度依赖性但差异无统计学意义（F=0.117，P=0.948），与DMSO对照组比较，0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR组差异均有高度统计学意义（t=19.414，P=0.003；t=30.468，P=0.001；t=102.233，P=0.000）。

本实验研究显示甲基化酶抑制剂5′-aza-dC可通过启动子甲基化而失活的Wif-1基因的异常甲基化状态得到逆转，而使该抑癌基因恢复其转录活性，以使该基因在肿瘤的发生发展中发挥可能的抑制肿瘤的作用。肿瘤的发生发展涉及多种途径和多种基因的改变，其中表观遗传学的变化逐渐受到医学研究的重视。异常甲基化是表观遗传学研究的一个重要内容，往往是导致抑癌基因失活的主要原因。本研究希望能通过对异常甲基化的进一步研究，来寻求结直肠肿瘤诊断的新标志物和治疗的新靶点。

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（收稿日期：2014-02-11 本文编辑：卫 轲）