5－硝基-2-（3-苯丙胺）苯甲酸对人脑胶质瘤SHG-44细胞增殖的作用及其机制

田 晶，齐 玲，金 宏，陈 雪，王春艳

（1.吉林医药学院生理学教研室，吉林 吉林 132013；2.吉林医药学院病理学教研室，吉林 吉林 132013；3.吉林医药学院实验中心，吉林 吉林 132013）

1 材料与方法

1.1 细胞和主要试剂 人脑胶质瘤SHG-44细胞

（吉林大学第一医院神经外科于洪泉主治医师提供），0.25%胰蛋白酶和小牛血清（美国Gibco公司），NPPB及四甲基偶氮唑（MTT） （美国Sigma公司），二甲基亚砜（DMSO） （美国Thermo公司）。取适量NPPB加入DMSO中，配制成终浓度为0.1mol·L－1的原液备用。

1.2 脑胶质瘤SHG-44细胞的培养 从液氮中取

出冻存的人脑胶质瘤SHG-44细胞，迅速放入37℃水浴箱中复苏，然后将细胞接种于培养瓶中，加入含10%小牛血清的RPMI-1640细胞培养液，将其置入37℃、5%CO2细胞培养箱中培养，隔日换液。

1.3 MTT法检测SHG-44细胞增殖活性 取对数生长期的SHG-44细胞，0.25%胰酶消化后，用含5%小牛血清RPMI-1640细胞培养液重悬细胞，

调整细胞浓度为5×104mL－1。将细胞均匀接种于±s表示，组间比较采用

t检验。

2 结 果

2.1 各组SHG-44细胞的增殖活性 NPPB作用96孔板中，每孔100μL，置入37℃、5%CO2细胞培养箱中进行培养。24h后加入NPPB（终浓度分别为0、50、100和200μmol·L－1），每个浓度设5个复孔，分别作用3、24和48h，每孔再加入MTT 20μL，继续孵育4h，弃上清每孔加入DMSO 150μL，震荡15min，酶联免疫检测仪490nm波长处测定各孔吸光度（A）值，以不加细胞的空白孔调零。

1.4 细胞分析仪检测SHG-44细胞周期 取对数生长期的SHG-44细胞，0.25%胰酶消化后，平均接种于25mm×25mm培养瓶中，每瓶1×106细胞，置入37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。24h后加入NPPB（终浓度分别为0、50、100和200μmol·L－1）继续培养24h。消化后用乙醇固定、染色，细胞分析仪检测细胞周期。计算各组细胞的增殖指数，增殖指数＝（S＋G2）期细胞百分数/（G1＋S＋G2）期细胞百分数。

1.5 细胞分析仪检测SHG-44细胞凋亡率 取对数生长期的SHG-44细胞，0.25%胰酶消化后，平均接种于4个25mm×25mm培养瓶中，每瓶1×106细胞，置入37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。24h后加入NPPB（终浓度分别为0、50、100和200μmol·L－1）继续培养24h。消化后Annexin V/PI染色，细胞分析仪检测各组细胞凋亡率。

1.6 统计学分析 应用SPSS 17.0统计软件进行统计学处理。细胞增殖活性、不同周期细胞所占百分率及细胞凋亡率以3h即可促进细胞增殖，200μmol·L－1NPPB组细胞增殖活性增加，与空白对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。与空白对照组比较，100和200μmol·L－1NPPB组在24和48h时，细胞增殖活性均明显降低（P＜0.01）。随着药物浓度增加和作用时间延长，NPPB对细胞增殖的抑制作用加强。见表1。

表1 各组SHG-44细胞增殖活性Tab.1 Proliferation activities of SHG-44cells in various groups （n＝5，±s）

表1 各组SHG-44细胞增殖活性Tab.1 Proliferation activities of SHG-44cells in various groups （n＝5，±s）

＊ P＜0.05，＊＊ P＜0.01compared with blank control group.

Group A value（t/h） 3 24 48 Blank control 0.79±0.08 1.50±0.15 1.72±0.38 NPPB（μmol·L－1）50 0.75±0.05 1.46±0.21 1.29±0.12＊100 0.90±0.12 0.98±0.04＊＊ 0.70±0.04＊＊200 1.09±0.19＊0.87±0.13＊＊ 0.46±0.06＊＊

2.2 各组SHG-44细胞周期时相变化 细胞分析仪结果显示：空白对照组G1期和S期细胞百分数分别为45.9%和23.1%，增殖指数为52.3%；在50μmol·L－1NPPB组，G1期细胞百分数减少，为40.6%，S期细胞百分数降到19.6%，增殖指数为59.2%；在100μmol·L－1NPPB组，G1期细胞百分数明显增多，为59.2%，而S期细胞百分数 降 到 14.5%，增 殖 指 数 为 40.6%；在200μmol·L－1NPPB 组，G1期细胞百分数为62.0%，S期细胞百分数为15.5%，增殖指数为37.7%。与空白对照组比较，各浓度NPPB组不同周期细胞百分数差异均具有统计学意义（P＜0.01）。说明低浓度NPPB促进细胞增殖，高浓度NPPB抑制细胞从G1期过渡到S期，使细胞增殖停滞在G0/G1期。见表2。

2.3 各组SHG-44细胞凋亡率 与空白对照组比较，100和200μmol·L－1NPPB组中细胞早期凋亡数与晚期凋亡数均明显增加，凋亡率分别达到24.64%和 41.85%（P＜0.01）。说 明 高 浓 度NPPB能诱导细胞凋亡，并具有浓度依赖性。见图1和表3。

表2 各组SHG44细胞周期时相Tab.2 Cell cycle of SHG－44cells in various groups（n＝3，±s，η/%）

表2 各组SHG44细胞周期时相Tab.2 Cell cycle of SHG－44cells in various groups（n＝3，±s，η/%）

＊ P＜0.01compared with blank control group.

Group Percentage of SHG-44cells G0/G1 S G2/M Blank control 45.90±1.08 23.10±0.62 29.20±0.59 NPPB（μmol·L－1）50 40.60±1.18＊ 19.60±0.60＊ 39.20±1.19＊100 59.20±0.36＊ 14.50±0.12＊ 26.10±0.26＊200 62.00±0.25＊ 15.50±0.06＊ 22.50±0.26＊

图1 各组SHG-44细胞凋亡率Fig.1 Apoptotic rates of SHG-44cells in various groups

3 讨 论

近年来，在多种细胞及肿瘤细胞普遍存在的容量调节氯通道（volume regulated anion channels，VRAC，ICl，vol）逐渐引起人们的关注。研究[1－5，7－10]表明：VRAC在细胞的容量调节、增殖、凋亡和迁移等功能中均有重要作用。细胞体积增加可以激活VRAC，通过调节性细胞体积减少和调节性细胞体积增加来 维持细 胞体积 的 稳 定[1－3，7－8]。细 胞 增殖是通过细胞周期实现的。G1期是细胞质复制的主要阶段，蛋白质、RNA和多聚核蛋白体都在此期合成，所以细胞容积明显增大。目前发现多种抑制细胞增殖的氯通道阻断剂均使细胞增殖停滞在G1期，这与本研究中100及200μmol·L－1NPPB抑制细胞增殖、使细胞增殖停滞在G1期的结果是一致的，说明VRAC参与细胞周期的进程。He等[8]发现：应用VRAC阻断剂DCPIB可以抑制星形胶质细胞增殖，使细胞周期停滞在G1/S期，并发现这与减少CDK 4和cyclin D1表达、增加p27表达有关，推断是通过影响ERK信号转导途径起作用的。本文作者发现：50μmol·L－1NPPB促进细胞增殖、加速细胞G1/S转换，但低浓度及高浓度NPPB引起的差异原因需进一步研究。VRAC在细胞凋亡中有重要作用。例如，氯通道阻滞剂NPPB阻抑顺铂诱导的鼻咽癌细胞凋亡[3]，减 轻 氧 化 应 激 引 起 的 C6 细 胞 损 伤[11]，VRAC受损使人肺腺癌细胞对顺铂耐药[12]，阻断VRAC可阻止细胞凋亡[4]，一些促进凋亡的中药可以激活 VRAC[6，13]等。然而，也有研究[14]发现：阻断VRAC可以促进细胞的凋亡。氯通道阻断剂引起细胞凋亡还是抑制凋亡尚有待进一步研究。

表3 各组SHG-44细胞凋亡率Tab.3 Apoptotic rates of SHG-44cells in various groups （n＝3，±s，η/%）

表3 各组SHG-44细胞凋亡率Tab.3 Apoptotic rates of SHG-44cells in various groups （n＝3，±s，η/%）

＊ P＜0.05，＊＊ P＜0.01compared with blank control group.

Necrotic rate Blank control 0.47±0.36 3.70±0.57 4.17±0.90 Group Apoptotic rate Early apoptosis Late apoptosis Total apoptosis 2.16±0.40 NPPB（μmol·L－1）50 0.27±0.19 4.11±0.63 4.38±0.79 1.26±0.02＊100 2.57±1.41＊＊ 22.07±3.22＊＊ 24.64±4.17＊＊ 3.23±1.34 200 3.95±1.77＊＊ 37.90±7.95＊＊ 41.85±9.35＊＊4.74±2.86

目前研究[1，4－5，7]发现：VRAC 参与凋亡可能有2种机制。凋亡性体积减小（apoptotic volume decrease，AVD）已在多种细胞凋亡中观察到，被认为是凋亡过程中具有普遍性意义的标志性事件。有研究[4，7，11－12]发现：K＋和 Cl－经钾通道和 VRAC外流是细胞出现AVD的一个重要因素。而AVD是驱动细胞死亡重要因素，给予VRAC阻断剂能够抑制凋亡性容积减少和细胞凋亡。另外，VRAC能够通过转运HCO3－直接降低细胞内pH值，也能够通过易化Cl－/HCO3－交换体分泌HCO3－来间接降低细胞内pH值。细胞内酸化后激活酸性核酸内切酶，进而参与细胞凋亡的过程[15－16]。本研究发现：高浓度NPPB可以抑制细胞增殖并促进细胞凋亡，NPPB是通过阻断VRAC发挥作用的还是另有其他途径诱发细胞凋亡有待进一步研究。肿瘤的发生与细胞增殖和凋亡的平衡失调密切相关，当某一因素促进细胞过度增殖并使凋亡减少时便促使肿瘤发生。本研究发现：高浓度NPPB可以抑制细胞增殖并诱发细胞凋亡，说明NPPB可以作为抗肿瘤新药进行研究和开发。

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