多粘菌素B与美罗培南联合用药对泛耐药铜绿假单胞菌体外抗菌活性的研究

刘立凡，陈佰义

（1.沈阳医学院附属第二医院 呼吸内科，辽宁 沈阳 110035；2.中国医科大学附属第一医院 感染科，辽宁 沈阳 110001）

多粘菌素B与美罗培南联合用药对泛耐药铜绿假单胞菌体外抗菌活性的研究

刘立凡1，陈佰义2

（1.沈阳医学院附属第二医院 呼吸内科，辽宁 沈阳 110035；2.中国医科大学附属第一医院 感染科，辽宁 沈阳 110001）

目的评价多粘菌素B与美罗培南体外联合应用对临床分离的30株泛耐药铜绿假单胞菌的抗菌效应。方法采用微量肉汤稀释法和棋盘法测定多粘菌素B与美罗培南单独用药和联合用药后，临床分离的30株泛耐药的铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC），及计算部分抑菌浓度指数（fractional inhibitory concentration，FIC），根据FIC指数判定联合效应类型，判断是否有协同或拮抗作用。结果多粘菌素B与美罗培南联用后，药物对泛耐药铜绿假单胞菌的MIC值均显著降低，FIC指数在0～0．5百分率为60%；FIC指数在0．5～1．0的百分率为30%。结论多粘菌素B与美罗培南联合用药后，以协同作用和相加作用为主，测定出分离的30株泛耐药铜绿假单胞菌的抗菌作用无拮抗作用。

泛耐药铜绿假单胞菌；多粘菌素B；美罗培南；联合用药；联合药物抑菌浓度

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 收集2011年01月～2012年12月中国医科大学附属第一医院病房铜绿假单胞菌进行分离，并随机选取泛耐药菌株30株（重症加强护理病房8株，呼吸病房6株，神经外科病房4株，神经内科病房2株），其中痰液标本28株，切口分泌物标本2株。为避免重复收集同一患者菌株，所有菌株均经过全自动微生物分析仪VITEK-2（购自法国Biomerieux公司，VITEK 32）细菌鉴定仪鉴定，采用K-B纸片扩散法进行药物敏感试验，参照美国临床实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)制定的标准对结果进行判断[5]。质控菌株：铜绿假单胞菌ATCC 27853，购于上海复祥生物科技有限公司。

1.1.2 抗菌药物 多粘菌素B（购自美国Amresco公司，BY 09059），美罗培南（购自中国药品生物制品检定所，BZ 2659）。

1.1.3 试剂及设备 Muller-Hinton(MH)琼脂培养基、肉汤（美国 Difco 公司，批号：200020919），96孔平板（美国Corning公司，型号：15041），VITEK全自动细菌分析仪（法国生物梅里埃公司，SH 11）、WGZ-2比浊仪（法国生物梅里埃公司），微量加样器（美国 Eppendorf公司，M 318928）。

1.2 方法

1.2.1 菌悬液配制 挑取已分纯、过夜的新鲜培养的细菌3～5个菌落，置于水解酪蛋白（Mueller-Hinton，MH）肉汤中接种，进行6 h增菌培养。按0.5 McFarland标准，在增菌培养后的菌液中注入3 mL MH肉汤校正其浊度，按5×105CFU/mL的标准用MH肉汤对菌液进行稀释。

1.2.2 抗菌药物储备液配制 用电子天平称取美罗培南、多粘菌素B（组合比例为1：1）适量，配制成浓度为5120 μg/mL的储备液。

1.2.3 微量肉汤稀释法 按 256 μg/mL、128 μg/mL、64 μg/mL、32 μg/mL、16 μg/mL、8 μg/mL、4 μg/mL、2 μg/mL、1 μg/mL、0.5 μg/mL、0.25 μg/mL、0.125 μg/mL、0.06 μg/mL、0.03 μg/mL 标准，用无菌水将每种抗菌药物依次倍比稀释成14个浓度。采用微量肉汤稀释法，测定多粘菌素和美罗培南对30株泛耐药菌株MIC，参照CLSI标准为判断标准[6]，采用棋盘设计法，在96孔板的横列和纵列中将不同浓度的2种药物各50 μL两两组合分别加入，不同浓度组合的2种药物混合液置于各孔中，然后在已混合溶液中加入100 μL菌液，最后轻微振荡混匀各孔溶液，置于37℃温箱进行16～20 h培养，观察结果。将分别应用2药的MIC值多粘菌素单独用药和MIC美罗培南单独用药及选择最佳联合用药效应时各自的MIC多粘菌素联合用药和MIC美罗培南联合用药记录结果，计算 MIC 几何均数（MICG）、50%抑菌浓度（MIC 50）、90%抑菌浓度（MIC 90），最后计算FIC指数。

1.2.4 联合药物分级抑菌浓度（FIC）指数的计算与效应类别判定[7]FIC指数＝MIC甲药联用/MIC甲药单独用药＋MIC乙药联合用药/MIC乙药单独用药。FIC指数＞2.0为拮抗作用，1.0＜FIC指数≤2.0为无关作用，0.5＜FIC指数≤1.0为相加作用，FIC指数≤0.5为协同作用。

2 结果

2.1 计算MIC 50和MIC 90 多粘菌素B与美罗培南单独用药、联合用药进行比较，MIC值下降，说明多粘菌素B和美罗培南联合用药后MIC值明显下降（见表1）。

表1 抗菌药物单独用药和联合用药对铜绿假单胞菌的MIC 50和MIC 90（μg/mL）Tab.1 MIC 50 and MIC 90 of polymyxin B and meropenem in single-use and in combination (µg/mL)

2.2 分级抑菌指数FIC构成比 实验结果显示，2药合用后FIC指数在0～0.5的为18株，占所有菌株数量的百分率为：60%；FIC指数在0.5～1的为9株，占所有菌株数量的百分率为：30%，FIC指数在1～2的为3株，占所有菌株数量的百分率为：10%，FIC指数＞2的为零。由此可见，2药联合用药对泛耐药铜绿假单胞菌抗菌作用主要为协同作用和相加作用。

3 讨论

铜绿假单胞菌是最常见的非发酵革兰阴性杆菌，当人体免疫力低下时，可成为机会致病菌，导致严重的医院感染。铜绿假单胞菌对多种抗生素有天然耐药性，耐药机制主要包括耐药基因突变、产生灭活酶、改变药物的作用靶点、药物渗透障碍与主动外排、形成生物膜等[8]，加之广谱抗生素的应用、各种侵入性诊断和治疗操作的不断普及、器官移植手术的增加、肿瘤放化疗的增加，使得铜绿假单胞菌的致病率不断增加。加之近年来临床中广泛应用、滥用广谱抗生素，使得铜绿假单胞菌对抗菌药物的敏感性下降，出现了获得性耐药菌株，在逐渐增多的多重耐药和泛耐药铜绿假单胞菌[9]出现的情形下，碳青霉烯类抗菌药物就成为了临床治疗的最后一道防线，但对泛耐药菌的治疗仍为临床医生面临的治疗难题[10]。由于新的抗菌药物研制的速度赶不上细菌耐药的速度的缺乏，所以临床上较少应用的老药回到了人们的视线，利用老药联合治疗耐药菌[11]就成了临床关注的焦点。

多粘菌素B是由多粘芽孢杆菌产生的一组多肽类抗生素，作用于革兰氏阴性菌细胞外膜的脂多糖，改变细菌细胞外膜渗透性，多粘菌素B被细胞摄取导致细菌死亡，多粘菌素B对革兰氏阴性菌敏感性较高，但是在近几十年中发现它有严重的神经毒性和肾毒性，所以临床应用受到限制。近年来，多粘菌素在多重耐药革兰氏阴性菌治疗方面的临床研究有所增多[12]，与其他类抗菌药物联合用药可以提高效果[13-15]。本实验中的30株铜绿假单胞菌对美罗培南均耐药，而对多粘菌素B的敏感率为86.7%，无耐药菌株，且多粘菌素B与美罗培南联用后，各自的MIC值均显著下降（P＜0.01）本实验多粘菌素B与美罗培南合用后FIC指数在0～0.5的百分率分别为：60%；FIC指数在0.5～1.0的百分率分别为：30%，说明多粘菌素B与美罗培南联合用药在对30株泛耐药铜绿假单胞菌抗菌作用中，无拮抗作用，主要为协同和相加作用，本研究为泛耐药细菌引起的难治感染的治疗提供实验依据，具体机制有待进一步研究。

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Study on the anti-bacteria effects of polymyxin B combined with meropenem against pan-drug-resistant pseudomonas aeruginosa

LIU Li-fan1, CHEN Bai-yi2

(1.Department of Respiratory Medicine, The Second Affiliated Hospital of Shenyang Medical College, Shenyang 110035, China;2.Department of Infectious Disease, The First Affiliated Hospital of China Medical University, Shenyang 110001, China)

ObjectiveTo evaluate the anti-bacteria effects of polymyxin B combined with meropenem against 30 strains pan-drug resistant pseudomonas aeruginosa that separated in clinic.MethodsThe minimal inhibitory concentration (MICs) of 30 strains pan-drug resistant pseudomonas aeruginosa after treated with polymyxin B and meropenem as single-use or combination use were determined by both microdilution method and checkerboard method. The FIC index was calculated, then the type of combination effect was determined according to FIC index, which was used to determine whether there was synergistic or antagonistic effects.ResultsThe MICs of pan-drug resistant pseudomonas aeruginosa were reduced significantly after polymyxin B combined with meropenem when compared with single-use. The percentages of the FIC index that less than 0.5 and the index between 0.5 and 1 were 60% and 30% respectively.ConclusionThe results indicate that the combinations of polymyxin B with meropenem have good synergistic and additive effects against pan-drug resistant pseudomonas aeruginosa, there is no antagonism.

pan-drug resistant pseudomonas aeruginosa; polymyxin B; meropenem; combination; fractional inhibitory concentration

R 378．9

A

1005-1678(2014)02-0040-03

铜绿假单胞菌（pseudomonas aeruginosa，PA）广泛分布于自然界，在健康人的呼吸道、皮肤表面等部位定植，当人体免疫力低下时，可引起呼吸道、伤口的感染，是医院感染常见的条件致病菌之一。近年来，铜绿假单胞菌在临床各类标本中的分离率逐渐上升，其分离率在非发酵细菌中位居第一位[1]，可引起多脏器和多系统的感染[2]，特别是抗菌药物的不规范应用的广泛存在，导致铜绿假单胞菌对临床常用的抗菌药物如喹诺酮类、β-内酰胺类、氨基糖苷类、碳青霉烯类等抗菌药物的耐药性不断增加，出现了多重耐药（multidrug resistance，MDR）菌株，甚至衍生出对除了多粘菌素外的常用抗菌药全部耐药的菌株，即为泛耐药(pandrug resance，PDR)菌株[3-4]，感染后死亡率高，使用单一抗菌药物的治疗效果不明显，甚至出现直接导致失败的情况，给临床研究和医疗服务带来了许多难题。为此，本研究探讨了多粘菌素B（polymyxin B）与美罗培南（meropenem）联合应用对临床分离并分纯的泛耐药铜绿假单胞菌（30株）的体外抗菌效应，希望能为临床联合应用抗菌药物治疗泛耐药菌感染提供参考。

2012年沈阳市卫生局科研课题（2011446）

刘立凡，女，硕士，主治医师，研究方向：免疫缺陷与条件致病菌，E-mail：liulifan_sy@163.com。