蒽贝素联合紫杉醇抑制肺癌A549细胞的增殖和荷瘤裸鼠肿瘤的生长研究

张春辉，孙平

（华中农业大学医院，湖北武汉 430070）

蒽贝素联合紫杉醇抑制肺癌A549细胞的增殖和荷瘤裸鼠肿瘤的生长研究

张春辉，孙平Δ

（华中农业大学医院，湖北武汉 430070）

目的研究蒽贝素联合紫杉醇对A 549细胞的增殖抑制作用和对肺癌异位瘤的生长抑制作用。方法采用MTT法研究蒽贝素联合紫杉醇对A 549细胞的增值抑制作用。流式细胞术检测蒽贝素联合紫杉醇诱导A 549细胞的凋亡率。构建裸鼠A 549肺癌异位瘤模型，研究蒽贝素联合紫杉醇对肺癌异位瘤的生长抑制作用。结果蒽贝素联合紫杉醇对A 549细胞的增殖抑制作用显著强于蒽贝素组和紫杉醇组，差异具有统计学意义（P＜0．01）。细胞凋亡实验结果显示，蒽贝素联合紫杉醇诱导A 549细胞凋亡率分别是蒽贝素组和紫杉醇组的4．8倍和2．4倍，差异具有统计学意义（P＜0．01）。荷瘤裸鼠治疗实验结果显示，蒽贝素联合紫杉醇对肺癌的生长抑制作用显著强于其他组（P＜0．01）。结论蒽贝素能够联合紫杉醇有效抑制A 549细胞的增殖及荷瘤裸鼠肿瘤的生长，是一种潜在的肺癌治疗方法。

蒽贝素；紫杉醇；肺癌

1 材料与方法

1.1 材料 胎牛血清购自浙江四季青生物科技有限公司；蒽贝素购自美国sigma公司；DMEM培养基购自赛默飞世尔生物化学制品（北京）有限公司；MTT试剂盒购自sigma公司；紫杉醇购自江苏恒瑞医药股份有限公司；其余试剂为分析纯。A549人源性肺癌细胞购自上海细胞研究所；雄性裸鼠购自山东大学医学院实验动物中心，动物许可证号：SDDX 2013-08231。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将A549细胞置于含有100 mg/L胎牛血清的DMEM培养基中培养，培养条件为5%CO2，湿度为13.5%，温度为37℃。待细胞汇合度为0.8～0.9时，用2.5 mg/L胰酶消化传代，取对数生长期细胞进行实验。

1.2.2 MTT实验考察不同药物干预对A549的增殖抑制作用 培养A549细胞接种于96孔板中，当孔板中细胞完全贴壁且处于对数生长期时加入无菌过滤后的紫杉醇（3 μg/mL）、蒽贝素（8 μg/mL）、紫杉醇+蒽贝素(紫杉醇，3 μg/mL +蒽贝素8μg/mL)各20 μL。将孔板移入37℃ CO2孵箱中培养24 h、48 h和72 h后取出，每孔加入20 μL 5 mg/mL MTT溶液，再放回孵箱中继续孵育4 h，将孔板中液体倒出，每孔加入200 μL DMSO，37℃避光振摇15 min，用酶标仪在490 nm处测定各孔的光密度值（OD）。

1.2.3 蒽贝素联合紫杉醇诱导A549细胞凋亡实验 为了检测蒽贝素联合紫杉醇诱导A549细胞的凋亡的作用，本研究按“1.2.2”项下培养细胞并给药，将A549细胞给药孵育24 h，然后用冰PBS清洗细胞3次，FITC/PI双染，细胞避光放置15 min，采用流式细胞仪检测细胞凋亡数量。

1.2.4 肺癌异位肿瘤模型的建立 A549细胞经胰酶消化，离心后将其悬浮于DMEM培养液中，计数调节浓度至5×107个/mL。取4～6周龄，体重20～25 g的雄性裸鼠，将准备好的A549细胞悬浊液皮下接种于裸鼠背部，每只裸鼠接种0.1 mL细胞悬浊液。接种后1～2周可见背部长出肿瘤块，证明接种成功。将优选后的24只荷瘤裸鼠随机分成4组，生理盐水组、紫杉醇干预组（10 mg/kg）、蒽贝素干预组（20 mg/kg）和紫杉醇+蒽贝素（紫杉醇，10 mg/kg+蒽贝素10 mg/kg）。各组均采用腹腔注射给药，每2 d测量1次肿瘤大小。第21天处死小鼠，剖肿瘤、照相。

2 结果

2.1 蒽贝素增强紫杉醇对肺癌A549细胞的增殖抑制作用

MTT实验结果显示，紫杉醇和蒽贝素对A549细胞均有一定的增殖抑制作用。当紫杉醇与蒽贝素联合用药时，对A549细胞的增殖具有更强的抑制作用，联合用药对A549细胞的抑制能力显著强于单独用药，差异具有统计学差异（P＜0.01，见图1）。

图1 不同药物干预组对A 549细胞增殖的影响

2.2 蒽贝素联合紫杉醇促进肺癌A549细胞凋亡细胞凋亡的定量实验结果表明，紫杉醇、蒽贝素和联合给药都能不同程度诱导肺癌细胞的凋亡。紫杉醇、蒽贝素和联合给药诱导A549细胞坏死和早期凋亡率分别为46.2%、25.4%和84.6%，而对照生理盐水组早期凋亡率为0.68%（见图2）。

图2 不同药物干预组对A 549细胞凋亡率的影响

2.4 蒽贝素联合紫杉醇抑制荷瘤鼠肿瘤的生长 各干预组对荷瘤裸鼠的治疗实验结果表明：相比于生理盐水组，紫杉醇组和蒽贝素组都能够显著抑制肿瘤的生长，荷瘤小鼠生长20 d后，生理盐水组小鼠肿瘤体积分别增至给药前肿瘤体积的2.42倍、蒽贝素干预组为2.18倍和紫杉醇干预组为1.55倍，而联合干预组肿瘤体积仅增至原体积的1.21倍，差异具有统计学意义（P＜0.01，见图 3）。

3 讨论

紫杉醇是临床常用的细胞毒类抗肿瘤药物。蒽贝素是一种XIAP的小分子抑制剂，能够通过抑制XIAP，进而诱导肿瘤细胞的凋亡。蒽贝素与其他化疗药物联用能够有效增强化疗药物对肿瘤细胞的抑制效果[13-15]。目前国内外尚未见到蒽贝素与化疗药物联合作用于肺癌的报道。

本研究将临床上已经证实的抗肿瘤药物紫杉醇与蒽贝素联合用于抑制肺癌A549细胞的研究，结果显示紫杉醇与蒽贝素联合使用能够显著抑制肺癌A549细胞的增殖。凋亡实验结果显示联合用药诱导肿瘤细胞凋亡的能力显著强于紫杉醇或者蒽贝素单独给药，这说明紫杉醇和蒽贝素联合给药能够对肿瘤细胞凋亡起到协同促进作用。此外，本研究还通过体内肿瘤异位模型考察了联合给药对肿瘤生长的抑制能力，结果与体外研究结果相一致。综上所述，紫杉醇和蒽贝素联合使用能够有效抑制肺癌的发展，是一种潜在的肺癌治疗手段。对于蒽贝素抑制肿瘤的机制可能与其阻断肿瘤细胞β-catenin信号途径，下调β-catenin核表达，上调其胞膜表达有关[14]。目前还在进一步的研究中。

图3 不同药物干预组对肺癌移植瘤的抑制率

[1] 韩宝惠．肺癌靶向治疗进展．山东省第七届肿瘤化疗会议暨首届“CSCO—山东”肿瘤论坛论文集．2008-06．

[2] 姜晗昉．白蛋白结合型紫杉醇治疗晚期乳腺癌的临床观察[J]．肿瘤，2013，33（3）：251-257．

[3] 刘云军．单周紫杉醇化疗方案在晚期卵巢癌的临床应用[J]．中华全科医学，2013，11（8）：1231-1232．

[4] 黄洪标．漆树酸联合紫杉醇对肝癌细胞生长抑制和凋亡的影响[J]．实用医学杂志，2013，29（7）：1044-1047．

[5] 王会敏．紫杉醇联合顺铂治疗晚期非小细胞肺癌临床观察[J]．中华全科医学，2011，9（9）：1397-1398．

[6] Ji X．Inhibition of cell growth and induction of apoptosis in non-small cell lung cancer cells by delta-tocotrienol is associated with notch-1 downregulation[J]．J Cell Biochem,2011,112：2773-2783．

[7] Husain,K．Vitamin E δ-Tocotrienol augments the antitumor activity of gemcitabine and suppresses constitutive NF-κB activation in pancreatic cancer[J]．Mol Cancer Ther,2011,10：2363-2372．

[8] Chitra M,Sukumar E,Suja V,et al．Antitumor,anti-inflammatory and analgesicproperty of embelin,A plant product[J]．Chemotherapy,1994,40：109-113．

[9] 郑玲．XIAP抑制剂Embelin体外对人胰腺癌细胞株的抑制效应与机制研究[J]．山西医科大学学报，2009，40（1）：20-22．

[10] 史朝晖．Embelin对大肠癌细胞株SW 480细胞增殖和凋亡的影响[J]．肿瘤防治研究2012，39（8）：954-956．

[11] Anja MS．Potent inhibition of human 5-lipoxygenase and microsomal prostaglandin E 2 synthase-1 by the anti-carcinogenic and anti-inflammatory agent embelin[J]．Biochemical Pharmacology,2013,86(4)：476-486．

[12] Suresh RN．Anti-diabetic activity of embelin： Involvement of cellular inflammatory mediators, oxidative stress and other biomarkers[J]．Phytomedici ne,2013,20(10)：797-804．

[13] Shunichi S．Randomized phase II trial of uracil/tegafur and cisplatin versus vinorelbine and cisplatin with concurrent thoracic radiotherapy for locally advanced unresectable stage III non-small-cell lung cancer：NJLCG 0601[J]．Lung Cancer,2013,81(1)：91-96．

[14] Kumar GK．Embelinreduces cutaneous TNF-α level and ameliorates skin edema in acute and chronic model of skin inflammation in mice[J]．European Journal of Pha rmacology,2011,662(1-3)：63-69．

[15] Badami,Veeresh PV．Protective effect of embelinagainst acetic acid induced ulcerative colitis in rats[J]．European Journal of Pharmacology,2011,654(1)：100-105．

Inhibitation of embelin and paclitaxel on lung cancer A549 cell proliferation
and tumor growing in tumor-bearing nude mice

ZHANG Chun-hui，SUN PingΔ

(Hospital of Central China Agricultural University, Wuhan 430070, China)

ObjectiveTo evaluate the effect of embelin combined with paclitaxel on the inhibition of A549 lung cancer cell proliferation and tumor growing in tumor bearing nude mice.MethodsThe anti-proliferation efficiency of embelin combined with paclitaxel were evaluated by MTT assay, and A549 cell apoptosis were evaluated by flow cytometry. A549 cells were xenografted in mice to establish the animal model, which were used to evaluate the effect of anti-tumor.Resultscompared to saline group、embelin group and paclitaxel group, the (paclitaxel + embelin) group could inhibit the growth of A549 cells effectively(P＜0.05). The embelin combined with paclitaxel induced the apoptosis of A549 cells more effective than paclitaxel alone. The (paclitaxel + embelin) group significantly inhibited the growth of tumor tissue.Conclusionthe paclitaxel can inhibit the growth of A549 cells, the embelin can induce the apoptosis of A549 cells, and the combination of paclitaxel and embelin may be a potentially effective treatment for lung cancer.

embelin;paclitaxel;lung cancer

R 734．2

A

1005-1678(2014)02-0007-03

肺癌作为严重威胁人类健康的头号恶性肿瘤，国内每年新发肺癌约50万，到2025年预计我国每年将有100万肺癌患者[1]。肺癌的治疗以手术为主，联合化疗为辅。紫杉醇是来源于红豆杉属太平紫杉的一种细胞毒性物质，被广泛用于乳腺癌[2]、卵巢癌[3]、肝癌[4]和非小细胞肺癌的治疗[5]。凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein，IAPs)是近年来备受瞩目的一类蛋白质家族，是一类独立于Bcl-2的抗凋亡蛋白。某些IAPs成员异常高表达常引起细胞凋亡受阻，与肿瘤的发生发展密切相关[6-8]。X连锁凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitorof apoptosis protein，XIAP)是半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂[9]。X连锁凋亡抑制蛋白是肿瘤细胞内抑制凋亡发生的重要蛋白之一。蒽贝素是一种XIAP的小分子抑制剂，能够通过抑制XIAP，进而诱导肿瘤细胞的凋亡[10-12]。本研究拟探讨蒽贝素联合紫杉醇对肺癌A549细胞增殖的影响以及对荷瘤小鼠肿瘤的治疗效果，为临床治疗提供更多的实验依据。

国家自然科学基金（81171365）

张春辉，女，本科，医师，研究方向：肺癌的基础与临床治疗研究，E-mail：zhc297167698@163.com；孙平,通信作者，男，本科，主治医师，研究方向：肺癌的基础与临床治疗研究，E-mail：2094252562@qq.com。