香菇多糖对平阳霉素抑制血管内皮瘤细胞增殖的影响

付桂莉，郑源泉，卢静静，黄美莲，李延

(1.武汉市儿童医院 皮肤科，湖北 武汉 430016；2.华中科技大学同济医学院附属协和医院 皮肤科，湖北 武汉 430022)

香菇多糖对平阳霉素抑制血管内皮瘤细胞增殖的影响

付桂莉1，郑源泉1，卢静静1，黄美莲1，李延2

(1.武汉市儿童医院 皮肤科，湖北 武汉 430016；2.华中科技大学同济医学院附属协和医院 皮肤科，湖北 武汉 430022)

目的研究香菇多糖对平阳霉素抑制血管内皮瘤细胞的增殖的影响。方法将EOMA小鼠血管内皮瘤细胞分别单用香菇多糖处理（LTN组）、单用平阳霉素处理（BLE组）、香菇多糖联合平阳霉素处理（L+B组）和未做任何处理（CON组），比较4组细胞处理前后细胞增殖和凋亡的差异。结果 CON组和LTN组作用后d 1-d 7的吸光度无显著差异，但均显著高于BLE组和L+B组（P＜0．05）；L+B组作用后d 1-d7的吸光度显著低于BLE组（P＜0．05）。BLE组和 L+B组 G 0/G1期和凋亡率显著高于 CON组和 LTN组（P＜0．05），S期、G 2/M期和 PI显著低于 CON组和 LTN组（P＜0．05）；L+B组G 0/G1期和凋亡率显著高于BLE组（P＜0．05），S期、G 2/M期和PI显著低于BLE组（P＜0．05）。结论香菇多糖可显著增强平阳霉素对小鼠血管内皮瘤细胞抑制增殖及促进凋亡的作用。

血管瘤；平阳霉素；香菇多糖；细胞增殖；凋亡

香菇多糖是临床上广泛应用的抗肿瘤药物，其作用机制与提高机体T淋巴细胞免疫和细胞毒性T细胞的杀伤作用有关，而香菇多糖自身对肿瘤细胞无直接抑制作用[1-2]。平阳霉素是由博莱霉素类抗肿瘤抗生素，能抑制肿瘤细胞DNA的合成，影响肿瘤细胞代谢，对多种肿瘤细胞具有杀灭作用[3-4]。本研究采用香菇多糖联合平阳霉素处理血管内皮瘤细胞，探讨香菇多糖体外对平阳霉素抑制血管瘤内皮细胞增殖的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 EOMA小鼠血管内皮瘤细胞购自美国典型培养物保藏中心，胎牛血清和DMEM购自Gibco公司，MTT试剂购自碧云天公司，香菇多糖购自南京康海药业有限公司，平阳霉素购自天津太河制药有限公司（国药准字：H12020933）。

1.2 细胞培养和药物处理 EOMA小鼠血管内皮瘤细胞完全培养基为10%胎牛血清和90%DMEM，培养在37℃、5%CO2恒温培养箱。香菇多糖经DMEM配制成1μmol/mL处理液，平阳霉素用生理盐水配制成1 mg/mL处理液。根据药物处理EOMA小鼠血管内皮瘤细胞方法分成CON组（仅完全培养基培养，未加入香菇多糖和平阳霉素）、LTN组（仅加入香菇多糖，香菇多糖终浓度0.1 μmol/L）、BLE组（仅加入平阳霉素，平阳霉素终浓度0.1 mg/mL）和L+B组（加入香菇多糖和平阳霉素，香菇多糖终浓度0.1 μmol/L，平阳霉素终浓度0.1 mg/mL）。4组细胞药物处理24 h后PBS清洗3次，完全培养基培养，检测其增殖和凋亡。

1.3 检测指标及方法，细胞增殖：采用MTT法检测，检测处理前（d 0）和处理d 1～d 7后酶标检测仪检测490 nm下的吸光值（A）并绘制细胞增殖曲线；细胞周期和凋亡：采用流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡，增殖指数（PI）=（S+G 2/M）/（G0/G1+S+G2/M）。

1.4 统计学方法 采用SPSS 13.0进行统计学分析。正态计量资料采用“±s”表示。4组间均数两两比较采用Student-Newman-Keuls法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞增殖比较结果 4组EOMA小鼠血管内皮瘤细胞药物作用前吸光度无明显差异，药物处理后4组细胞d 1-d 7吸光度逐渐升高；CON组和LTN组作用后d 1-d 7的吸光度无显著差异，但均显著高于BLE组和L+B组（P＜0.05）；L+B组作用后d 1-d 7的吸光度显著低于BLE组（P＜0.05，见图1）。

图1 4组EOMA小鼠血管内皮瘤细胞d 0～d 7吸光值Fig.1 Absorbance of EOMA cells in d 0～d 7 after treatment in four groups*P＜0.05，与CON组和LTN组相比，compared with CON group and LTN group；﹟P＜0.05，与 BLE 组对比，compared with BLE group

2.2 细胞周期和凋亡比较 CON组和LTN组EOMA小鼠血管内皮瘤细胞G0/G1期、S期、G2/M期、PI和凋亡率的差异无统计学意义；BLE组和L+B组G0/G1期和凋亡率显著高于CON组和LTN组（P＜0.05），S期、G2/M期和PI显著低于CON组和LTN组（P＜0.05）；L+B组G0/G1期和凋亡率显著高于BLE组（P＜0.05），S期、G2/M期和PI显著低于BLE组（P＜0.05）（见表 1）。

表1 4组EOMA小鼠血管内皮瘤细胞细胞周期和凋亡对比（%）Tab.1 Comparision of cell cycle, PI and apoptosis rates in EOMA cells among four groups(%)

3 讨论

平阳霉素是平阳链霉菌产生的博莱霉素类抗肿瘤抗生素，能抑制肿瘤细胞DNA的合成，影响肿瘤细胞代谢，促进癌细胞变性、坏死，体内外实验证明平阳霉素肝癌、消化道肿瘤和血管瘤等肿瘤细胞均有较强的杀灭作用[5-7]。平阳霉素为细胞周期非特异性药物，研究表明平阳霉素产生的OH-与DNA结合，抑制DNA复制，将细胞阻滞在G0/G1期和S期，这种抑制作用呈剂量依赖性[8-9]。平阳霉素的抗肿瘤作用还与其诱导肿瘤细胞凋亡有关，高浓度的平阳霉素可诱导肿瘤细胞启动程序性死亡程序。香菇多糖是典型的T细胞激活剂，在临床上广泛应用于各种肿瘤的治疗，可显著提高抗肿瘤药物的疗效并降低其不良反应，因香菇多糖自身对肿瘤细胞无直接杀灭作用，故目前对香菇多糖在体外中能否增强抗肿瘤药物对肿瘤细胞的杀灭作用尚存在极大争议。本研究中，L+B组EOMA小鼠血管内皮瘤细胞d 1-d 7的吸光度显著低于BLE组（P＜0.05），而G0/G1期和凋亡率显著高于BLE组（P＜0.05），S 期、G2/M期和 PI显著低于 BLE 组（P＜0.05），证实平阳霉素对肿瘤细胞增殖抑制及促进凋亡作用，同时表明体外实验中香菇多糖可增强平阳霉素对肿瘤细胞的杀灭作用。

本研究中，CON组和LTN组作用后d 1～d 7的吸光度、G0/G1期、S期、G2/M期、PI和凋亡率无明显差异，证实香菇多糖自身对肿瘤细胞增殖和凋亡无明显作用。体内实验表明香菇多糖通过改善机体免疫功能而增强抗肿瘤药物的抗肿瘤作用，而在体外细胞实验中无体内免疫环境，故香菇多糖体外增强化疗药物的抗肿瘤作用可能存在其他作用机制[10]。体外细胞实验表明香菇多糖可抑制肿瘤细胞耐药基因的表达，从而增加肿瘤药物在肿瘤细胞内的浓度[11]。目前发现耐药基因包括多药耐药基因（multidrug resistance gene 1，MDR 1）、多药耐药相关蛋白（multidrug resistance protein，MRP）和肺耐药蛋白（lung resistance protein，LRP），MDR可利用ATP水解功能将抗肿瘤药物泵出胞膜外；MRP可将带负电荷的药物分子逆浓度泵出到细胞外，降低抗肿瘤药物在细胞内的浓度，同时改变细胞内的pH值，抑制抗肿瘤药物与靶点的结合；LRP可阻止抗肿瘤药物进入细胞核，还可将进入胞浆的抗肿瘤药物转运到运输囊泡中，通过胞吐的方式排出细胞外[12-13]。体内外细胞实验表明，肿瘤细胞存在原发耐药基因表达，采用大剂量平阳霉素可诱导肿瘤细胞MRP和P-gp表达增加从而产生耐药性，而逆转耐药基因表达后可增强平阳霉素对其的杀灭作用[14-15]。基于这些证据，推测本研究中香菇多糖是通过降低耐药基因的表达从而提高平阳霉素对血管内皮瘤细胞的抑制增殖和促进凋亡作用。

[1] Zhao L,Xiao Y,Xiao N．Effect of lentinan combined with docetaxel and cisplatin on the proliferation and apoptosis of BGC 823 cells[J]．Tumour biology 2013 34(3)：1531-1536．

[2] Wang JL,Bi Z,Zou JW,et al．Combination therapy with lentinan improves outcomes in patients with esophageal carcinoma[J]．Mol Med Rep,2012,5(3)： 745-748．

[3] Yang Y,Sun M,Ma Q,et al．Bleomycin A 5 sclerotherapy for cervicofacial lymphatic malformations[J]．Journal of vascular surgery,2011,53(1)：150-155．

[4] Hou R,Guo J,Hu K,et al．A clinical study of ultrasound-guided intralesional injection of bleomycin A 5 on venous malformation in cervical-facial region in China[J]．Journal of vascular surgery,2010,51(4)：940-945．

[5] Aouida M,Ramotar D．A new twist in cellular resistance to the anticancer drug bleomycin-A 5[J]．Current drug metabolism,2010 11(7)：595-602．

[6] 刘曦，罗小平，曹闻挺，等．平阳霉素混合碘油经动脉化疗栓塞抑制兔VX2肝癌生长的实验研究[J]．中华肝脏病杂志，2012，20（8）：611-616．

[7] 王莹，吴淑英，甄永苏，等．蛋白酶抑制剂leupeptin增强抗肿瘤药物对肿瘤细胞的增殖抑制作用[J]．医学研究杂志，2012，41（10）：56-60．

[8] 李鹏，肖小娥，郭正团，等．平阳霉素对婴幼儿血管瘤细胞系 XTPS-1作用的实验研究[J]．中华口腔医学杂志，2012，47（6）：324-328．

[9] 贾玉林，赵怡芳，贾俊，等．平阳霉素对人静脉畸形内皮细胞增殖活性和细胞形态的影响[J]．华中科技大学学报（医学版），2011，40（6）：674-677．

[10] 叶茂，周毅．顺铂联合香菇多糖对肺癌并发恶性胸腔积液患者胸水调节性T细胞的影响及意义[J]．浙江医学，2014，（2）：124-126，129．

[11] 袁昌劲，孔庆志，卢宏达，等．香菇多糖增强5-FU抑制结肠癌细胞增殖机制研究[J]．中国实验诊断学，2012，16（6）：992-994．

[12] 何志惠，苏群豪，洪涛，等．非小细胞肺癌 P-gp、LRP表达及其与预后的相关性[J]．中国老年学杂志，2013，33（16）：3832-3833．

[13] Baumert C,Gunthel M,Krawczyk S,et al．Development of small-molecule P-gp inhibitors of the N-benzyl 1,4-dihydropyridine type：novel aspects in SAR and bioanalytical evaluation of multidrug resistance (MDR) reversal properties[J]．Bioorganic and medicinal chemistry,2013,21(1)：166-177．

[14] 王青，孙小兰，羊小海，等．单分子力谱研究活细胞上多药耐药相关蛋白1的表达[J]．高等学校化学学报，2012，33（7）：1401-1406．

[15] 张琼，郑国沛，谭小军，等．平阳霉素诱导的人舌癌多药耐药相关蛋白质表达谱的建立[J]．国际病理科学与临床杂志，2012，32（3）：193-199．

Effects of lentinan on bleomycin A5’s inhibition effects in hemangioma-derived endothelial cell

FU Gui-li1, ZHENG Yuan-quan1, LU Jing-jing1, HUANG Mei-lian1, LI Yan2

(1.Department of Dermatology, Wuhan Children's Hospital, Wuhan 430016,China; 2.Department of Dermatology, Union Hospital, Tongji Medical college, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022,China)

ObjectiveTo study the effects of Lentinan on bleomycin A5’s inhibition effects in hemangioma-derived endothelial cell.MethodsHemangioma-derived endothelial cell line EOMA were divided into LTN group (only lentinan treatment), BLE group (only bleomycin A 5 treatment),L+B group (Lentinan and bleomycin A5 treatment) and CON group (no lentinan and bleomycin A5 treatment). Cell proliferation, cell cycle, PI and apoptosis were detected and compared among four groups.ResultsThe differences of absorbance in LBE group was significantly higher than that in L+B group after treatment for d 1-d 7 (P＜0.05), but both of them were significantly lower than in CON group and LTN group (P＜0.05). The G 0/G 1 stage and apoptosis rate in L+B group was significantly higher than in BLE group(P＜0.05), while it was significantly lower in S stage, G 2/M stage and PI(P＜0.05).ConclusionLentinan could significantly enhance bleomycin A5’s inhibition effects on hemangioma-derived endothelial cell.

hemangioma; bleomycin A5; lentinan; cell proliferation; apoptosis

R 735

A

1005-1678(2014)02-0020-02

国家自然科学基金青年科学基金（30901287）

付桂莉，女，硕士，主治医师，研究方向：儿童皮肤疾病诊断与治疗，E-mail：157047064@qq.com。