人参皂苷R g 3联合奥沙利铂和索拉非尼对肝癌细胞凋亡的影响

鲍建勋,王号飞,黄云娟

（舟山医院 药剂科，浙江 舟山202451 ）

人参皂苷R g 3联合奥沙利铂和索拉非尼对肝癌细胞凋亡的影响

鲍建勋,王号飞,黄云娟

（舟山医院 药剂科，浙江 舟山202451 ）

目的探讨人参皂苷Rg3联合奥沙利铂和索拉非尼对诱导人肝癌细胞凋亡的影响。 方法 分别将人参皂甙Rg 3、索拉菲尼、奥沙利铂3种药物分为单药、两药联合、和三药联合作用于人肝癌细胞，观察细胞增殖情况、早期凋亡情况、中晚期凋亡情况。结果 3种药物联合对肝癌细胞的抑制率、细胞凋亡率和凋亡指数显著高于单用一种药物以及两种药物联用（P＜0.01）。 结论 联合人参皂苷Rg 3、奥沙利铂以及索拉菲尼能够显著提高肝癌细胞的凋亡率。

人参皂苷Rg 3；奥沙利铂；索拉非尼；肝癌细胞；凋亡

原发性肝癌是临床常见肿瘤，患者多预后差。原发性肝癌起病隐匿，发展迅速，部分患者发现时已经失去了手术治疗的机会，因此药物治疗是中晚期原发性肝癌的主要治疗方法之一。奥沙利铂、索拉菲尼等是近年来涌现的一些新药，能够一定程度上改善患者的疗效[1-2]。人参皂苷Rg3是从人参中提取的成份，具有抑制肿瘤细胞转移、抑制肿瘤增殖、诱导肿瘤细胞凋亡等作用[3]。本实验主要研究人参皂甙Rg3、奥沙利铂、索拉菲尼三种药物单独和联合使用时对肝癌细胞凋亡的影响。现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 一般材料 试验细胞为人肝癌细胞株（购买于上海艾研生物科技有限公司）。根据不同作用药物分组。其中人参皂苷Rg3作用组简称人组，奥沙利铂作用组简称奥组，索拉菲尼作用组简称索组，人参皂苷Rg3联合奥沙利铂组简称人奥组，人参皂苷Rg3联合索拉菲尼组简称人索组，奥沙利铂联合索拉菲尼组简称奥索组，人参皂苷Rg3联合奥沙利铂和索拉菲尼在胃人奥索组。另设阴性对照组。

1.2 研究方法

1.2.1 培养液和药物储存液的配置 培养液：加10% 胎牛血清和1%青链霉素于RPMI-1640培养基。索拉菲尼药物储存液：索拉菲尼碾碎，去包衣，溶于100%DMSO中，过滤除菌，冻存。奥沙利铂药物储存液：溶于葡萄糖水中，冻存。人参皂苷Rg3药物储存液：溶解于无菌蒸馏水中，冻存。药物储存液使用时用培养基稀释，奥沙利铂浓度为1 μg/mL，索拉菲尼浓度为1 μ mol/L，人参皂苷Rg3浓度为30 μg/mL。

1.2.2 肝癌细胞培养传代 肝癌细胞株复苏，接种与培养瓶中，37℃培养。细胞贴壁70%～80%时进行传代。弃去培养液，PBS液冲洗培养瓶壁，加入含EDTA的胰蛋白酶消化，细胞出现间隙时洗出胰蛋白酶，加入培养液中止消化。细胞混悬液取出后离心，弃去上清，加培养液，1∶5传代培养。实验细胞为对数生长期细胞。

1.3 观察指标

1.3.1 各组细胞增殖的影响 取对数生长的细胞制成单细胞悬液，接种，37℃、5%CO2饱和湿度下培养。24 h后加入相应药物。阴性对照组加入RPMI-1640培养基100 μL。空白组加入RPMI-1640培养基200 μL。放入培养箱中培养48 h，加入5 mg/mL MTT液，孵育4 h，加入DMSO，震荡后，测490 nm波长的吸光度。细胞增殖抑制率=[1-（实验组平均吸光度值-空白孔平均吸光度值）/（阴性对照组平均吸光度值-空白孔平均吸光度值）]×100%。

1.3.2 细胞凋亡情况 取对数生长期的肝癌细胞，制成单细胞悬液后，接种于6孔板，培养24 h，加入相应的药物300 μ L，对照组加入等量培养基。48 h后收集上清液于流式管，6孔板内加不含EDTA的消化液，细胞变圆、出现细胞间隙后终止消化，收集入流式管，离心，收集细胞，PBS液冲洗，离心后弃去上清，加入Bingding Buffer 500 μL重悬细胞，加入Annexin V-FITC 10 μ L，加入 Propidium Iodide 5 μL，混匀，避光，室温反应。采用流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.3.3 细胞凋亡情况 取对数生长期的肝癌细胞，制成单细胞悬液，接种在6孔板内，6孔板装有灭菌盖玻片。培养，爬片

24 h。加入相应的药物300 μL，对照组加入等量的培养基。培养

48。TUNEL法检测细胞凋亡情况。凋亡指数=凋亡细胞数/总细胞数×100%。

1.4 统计学方法 采用SPSS 15.0统计学软件数据处理，正态计量资料采用“均数±标准差”表达，采用F检验或t检验进行数据处理。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞增殖抑制情况 3种药物联合对肝癌细胞的抑制率显著高于单用1种药物以及2种药物联用的抑制率（P＜0.01，见表1）。

表1 各组细胞增殖抑制情况Tab.1 Iinhibition results of cell proliferation

2.2 细胞凋亡率和凋亡指数 各组细胞凋亡率和凋亡指数见表2。

表2 细胞凋亡率和凋亡指数Tab.2 Aapoptosis rate and apoptotic index

3 讨论

凋亡是细胞程序化死亡，癌症的发生发展与癌症细胞凋亡程序异常有关，肿瘤与凋亡受抑和过度增殖具有密切的相关性，肿瘤的发生发展过程中，肿瘤细胞凋亡减少,而药物能够诱导肝癌细胞发生凋亡，从而达到治疗的目的[4-5]。凋亡相关的基因包括Bcl-2基因家族、Caspase家族等[6]。Bcl-2是抑制凋亡的基因，阻止细胞的凋亡，具有致癌作用[7]。Bax是诱导细胞凋亡的基因，与Bcl-2有拮抗作用，两者共同调节着细胞的凋亡。Caspase家族中Caspase-3在凋亡执行方面发挥重要的作用，活化的Caspase-3能够诱导细胞凋亡[8]。

奥沙利铂属于新的铂类抗癌药，通过产生烷化结合物作用于DNA，形成链内和链间交联，从而抑制DNA的合成，产生细胞毒作用和抗肿瘤活性[9]。研究显示:奥沙利铂可通过诱导肝癌细胞的HCCLM3和Hep3 B细胞凋亡，其通过启动内源性细胞凋亡途径而诱导细胞的凋亡。在本次研究中，使用奥沙利铂的肝癌细胞，其细胞凋亡率和凋亡指数显著高于对照组。索拉非尼是一种新型多靶向性的治疗肿瘤的口服药物，是一种多激酶抑制剂，能同时抑制多种存在于细胞内和细胞表面的激酶，包括RAF激酶、血管内皮生长因子受体-2（VEGFR-2）、血管内皮生长因子受体-3（VEGFR-3）、血小板衍生生长因子受体－β（PDGFR－β）、KIT和FLT-3，可以通过抑制RAF/MEK/ERK信号传导通路，直接抑制肿瘤生长；又可通过抑制VEGFR和PDGFR而阻断肿瘤新生血管的形成，间接抑制肿瘤细胞的生长[10-11]。在本次研究中，索拉菲尼组的细胞凋亡率和凋亡指数显著高于对照组。人参皂苷Rg3是人参中的有效活性成分，是一种人参二醇类四环三萜皂苷, 具有较好的抗癌、抗癌转移作用[12]。Rg3能显著提高荷瘤小鼠的免疫功能；抑制肿瘤内新生血管形成；阻止脱落癌细胞在血管壁的着床；抑制肿瘤细胞对血管壁基底膜的浸润，有显著抗浸润、抗转移作用。临床实验证实:Rg3能有效抑制肺癌、肝癌、胃癌、肠癌、乳腺癌生长，明显改善临床症状、提高生存质量、预防和治疗癌症[13-14]。主要作用于G2期，有效抑制肿瘤细胞有丝分裂前期蛋白质和ATP的合成，使肿瘤细胞增殖速度减慢。人参皂甙Rg3可选择性抑制癌细胞的浸润，对肿瘤还有抗转移的作用，抑制血管内皮细胞的增殖，促进癌细胞的凋亡，提高免疫功能等[15]。在本次研究中，使用人参皂苷Rg3组的细胞凋亡率和凋亡指数显著高于对照组。分别两药联合的各组中，奥沙利铂和人参皂苷Rg3联合以及奥沙利铂和索拉菲尼联合对肝癌细胞的抑制作用相似，高于索拉菲尼联合Rg3组。将三者联合后，肝癌细胞的抑制率最高，肝癌细胞的凋亡率和抑制指数也最高，说明三者联合能够显著提高疗效。

综上所述，联合人参皂苷Rg 3、奥沙利铂以及索拉菲尼能够显著提高肝癌细胞的凋亡。本文的研究不足之处在于本研究为实验研究，3种药物同时使用是否会增加不良反应还需要进一步研究。

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Effect of Ginsenoside-Rg combined with oxaliplatin and sorafenib on hepatic carcinoma cell apoptosis

BAO Jian-xun,WANG Hao-fei,HUANG Yun-juan
(Pharmacy Department, Zhoushan Hospital, Zhoushan 202451, China)

ObjectiveTo discuss the effect of Ginsenoside-Rg combined with oxaliplatin and sorafenib on hepatic carcinoma cell apoptosis。MethodGinsenoside-Rg, oxaliplatin and sorafenib were divided into single drug group, two drugs group and three drugs group to act on hepatic carcinoma cell. Multiplication, prophase apoptosis, middle and advanced stage apoptosis were observed。ResultsTo combine three drugs could improve hepatic carcinoma cell inhibition ratio, apoptosis ratio, apoptotic index compared to those of two drugs group or single drugs group（P＜0.01）。ConclusionTo combine Ginsenoside-Rg, oxaliplatin and sorafenib can improve hepatic carcinoma cell inhibition ratio.

Ginsenoside-Rg; oxaliplatin; sorafenib; hepatic carcinoma;apoptosis

R 735.7

A

1005-1678(2014)01-0041-03

鲍建勋，男，主管药师，研究方向：临床药学，E-mail：550952840@qq.com。