链霉菌I06A-03304产生的二酮哌嗪类化合物的纯化及结构鉴定

蒋忠科++++++张洋++++++郭连宏++++++姜蓉++++++孙承航

[摘要] 目的 分离鉴定链霉菌I06A-03304发酵液中具血管内皮细胞生长因子受体-2胞内酪氨酸激酶（VEGFR2-CD）抑制活性的次生代谢产物。 方法 采用大孔吸附树脂、羟丙基葡聚糖凝胶（Sephadex LH-20）、C-18反相色谱（ODS）、高压液相色谱（HPLC）等分离手段对次生代谢产物进行分离纯化；通过二级质谱（ESI+-MS2）、紫外光谱（UV）、红外光谱（IR）、核磁共振波谱（NMR）对其结构进行鉴定，以酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测其次生代谢产物对VEGFR2-CD的抑制活性。 结果 分离得到两个二酮哌嗪类化合物：3304A和3304C；化合物3304A的化学结构与环（脯氨酸-亮氨酸）一致，化合物3304C的化学结构与环（脯氨酸-苯丙氨酸）一致，均对VEGFR2-CD表现出一定的抑制活性。 结论 化合物3304A和3304C是具有VEGFR2-CD抑制活性的二酮哌嗪类次生代谢产物，并为本研究首次报道。

[关键词] 血管内皮细胞生长因子受体-2胞内酪氨酸激酶；链霉菌；二酮哌嗪；拮抗剂

[中图分类号] R96[文献标识码] A[文章编号] 1673-7210（2014）06（c）-0004-05

Isolation, purification and structural identification of diketopiperazines produced by streptomyces strain I06A-03304

JIANG Zhongke ZHANG Yang GUO Lianhong JIANG Rong SUN Chenghang

Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China

[Abstract] Objective To discover antagonists of VEGFR2-CD from the fermentation broth produced by streptomyces strain I06A-03304. Methods Under guidance of ELISA assay against VEGFR2-CD, compounds 3304A and 3304C were isolated and purified by HP-20 absorption resin, Sephadex LH-20 gel, ODS reversed-phase chromatography and semi-preparative HPLC. The structures of compounds 3304A and 3304C were identified by combination of analysis of UV, IR, ESI+-MS2 and NMR. Results Compounds 3304A and 3304C were purified and structurally identified as diketopiperazines, and were the same with cyclo-(Pro-Leu) and cyclo-(Pro-Phe) respectively. Compounds 3304A and 3304C showed weak antagonistic activity against VEGFR2-CD by ELISA assay. Conclusion For the first time, it is reported diketopiperazine compounds 3304A and 3304 C have antagonistic activity against VEGFR2-CD.

[Key words] VEGFR2-CD; Streptomyces; Diketopiperazines; Antagonist链霉菌属是主要的抗生素产生菌，该属微生物能合成具有各种生物活性的结构多样的次生代谢产物，是微生物药物的重要源泉[1]。VEGFR2是介导血管内皮生长因子（VEGF）活性的主要受体，VEGFR2拮抗剂能抑制VEGF活性，从而达到有效抑制肿瘤生长和转移的目的[2-3]。因此，以VEGFR2为靶点开发抗肿瘤药物是重点研究的方向，目前已有Sorafenib、Sunitinib、Pazopanib等药物上市[4]。VEGFR2-CD是具有受体酪氨酸激酶活性的VEGFR2胞内区，来自Genshi等[5]和Solowiej等[6]的研究结果表明，以VEGFR2-CD替代VEGFR2进行高通量筛选VEGFR2的抑制剂是可行的。目前，微生物来源的VEGFR2抑制剂报道较少，因此，以VEGFR2-CD为靶点对微生物次级代谢产物进行高通量筛选，进而快速发现微生物来源的VEGFR2的抑制剂，为开发新的抗肿瘤药物提供先导化合物，同时研究结果也将为该类微生物药物的开发提供有益的借鉴。前期笔者以VEGFR2-CD为靶点对链霉菌代谢产物进行筛选，获得了一株阳性链霉菌株：I06A-03304。本研究对链霉菌 I06A-03304产生的活性二酮哌嗪类化合物的分离纯化、结构鉴定及其对VEGFR2-CD的拮抗活性进行报道。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株链霉菌I06A-0334来自中国医学科学院&北京协和医学院医药生物技术研究所（以下简称“本所”）菌种筛选中心，菌种由本所生物工程室保存。

1.1.2 培养基链霉菌I06A-03304的种子和发酵培养基：葡萄糖5 g，麦芽浸粉5 g，牛肉浸膏5 g，玉米浆4 g，蛋白胨5 g，淀粉20 g，黄豆饼10 g，碳酸钙4 g，蒸馏水1 L，pH = 7.1；链霉菌I06A-03304的斜面ISP2（YM）培养基：麦芽浸粉10 g，酵母粉4 g，葡萄糖4 g，琼脂12 g，蒸馏水1 L，pH 7.1。

1.1.3 实验试剂甲醇、三氟乙酸、丙酮、乙酸乙酯、氯化钠（北京化工厂，分析纯）；乙腈（美国SK Chemicals 公司，HPLC级）；Poly（E4Y）、Na3VO4、Tween-20、重组KDR-CD（美国Sigma公司）；辣根过氧化酶标记的山羊抗小鼠lgG（H+L）抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司）；小鼠磷酸化的酪氨酸抗体（PY99）（美国Santa Cruz Biotechnology公司）；MTT（北京中山生物技术有限公司）；辣根过氧化酶显色底物TMB/H2O2 （中国医学科学院基础医学研究所）；PBS缓冲液：Na2HPO4 0.363%、KH2PO4 0.024%、NaCl 0.8%、KCl 0.02%，pH = 7.4；PBST缓冲液：0.1% Tween-20 的PBS缓冲液。

1.1.4 分离填料Sephadex LH-20（瑞典Pharmacia公司，上海化学试剂厂分装）、XAD-5型大孔吸附树脂（天津南开大学化工厂）；ODS/C18 柱色谱介质（日本Shimadzu公司）；HPLC分析柱：Zorbax SB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）和HPLC半制备柱：Zorbax SB-C18（9.4 mm×250 mm，5 μm）均为美国安捷伦公司产品。

1.1.5 仪器酶标比色仪（Bio-Rad 680，美国）；高压液相色谱仪（Agilent 1200，美国）；紫外分光光度计（岛津 UV2550，日本）；低速离心机（北京科瑞公司）；旋转蒸发仪（步琪Buchi-011，瑞士）；质谱仪（赛默飞世尔 LTQ-Orbitrap，美国）；傅里叶变换红外光谱图仪（热电公司 Nicolet 5700，美国）；真空冷冻干燥机（爱德华 Modulyo，英国）；核磁共振仪（瓦里安VNS-600型600M，瑞士）。

1.2 方法

1.2.1 菌株的发酵将生长良好的菌株I06A-03304斜面接种于含50 mL种子培养基的250 mL 三角烧瓶中，在 28℃、250 r/min摇床上旋转振荡培养48 h，然后按5%的接种量转接于含100 mL发酵培养基的500 mL三角瓶中，28℃、180 r/min摇床上旋转振荡培养96 h，收获发酵液。

1.2.2 活性检测方法[7]化合物的VEGFR2-CD拮抗活性测定运用ELISA法。采用10倍稀释法，获得化合物3304A、3304C浓度为10、1、0.1、0.01、0.001 mg/mL的样品。本实验中设立样品空白对照，抑制率（%）=[1-（A450样品/A450空白对照）]×100%。

1.2.3 化合物3304A和3304C的分离纯化将30 L发酵液过滤，滤液通过XAD-5型大孔树脂，收集流出液，再分别用20%、80%丙酮水2倍体积洗脱，对洗脱组分进行活性检测，将具有VEGFR2-CD抑制活性的80%丙酮水部分减压浓缩，用少量60%甲醇溶解，上样于Sephadex LH-20柱，60%甲醇水洗脱，收集橘黄色的活性带，得橘黄色粗品A。将粗品A用少量25%甲醇水溶解，上样于ODS反相柱，以25%、50%、80%、100%甲醇水2倍柱体积梯度洗脱。活性组分集中在50%甲醇水洗脱部分，将该部分样品减压浓缩得半纯品B。将B用少量30%乙腈溶解，用半制备HPLC进行制备（流动相：20%乙腈水，流速：1 mL/m，检测波长：215 nm），收集保留时间分别为25.5、29.5 min的活性峰，冷冻干燥得纯品3304A（12.0 mg）、3304C（3.3 mg）。用HPLC对所得化合物进行纯度检测（流动相：30%乙腈水，流速：0.5 mL/m，检测波长：215 nm），3304A、3304C 的保留时间分别为8.8、9.9 min，纯度分别为94.1% 和94.2%。

2 结果

2.1 化合物3304A的理化性质与结构鉴定

化合物3304A为白色无定型粉末，易溶于乙腈、甲醇和二甲基亚砜（DMSO），不溶于环己烷，微溶于水。化合物3304A在甲醇溶液中的紫外光谱（UV）呈末端吸收。IR在3434、2951、2876、1670、1634和1434 cm-1 处有较强吸收，比旋光度为-137.5°（浓度为0.48 mg/mL，乙醇）。1H-NMR（CDCl3， 600 Mz）δ：3.52~3.62（2H，m，3-H），1.85~1.94（1H，m，4a-H），1.99~2.03（1H，m，4b-H），2.10~2.16（1H，m，5a-H），2.32~2.37（1H，m，5b-H），4.10~4.13（1H，m，6-H），4.00~4.02（1H，m，9-H），1.49~1.54（1H，m，10a-H），2.05~2.09（1H，m，10b-H）， 1.68-1.76 （1H， m，11-H ），0.95 （3H，J = 6.6，12-H），1.00 （ 3H，J = 6.6，13-H），5.82（1H，s，N-H）；13C-NMR（CDCl3，150 Mz ）δ：166.11（C-1），45.50（C-3），22.73（C-4），28.11（C-5），58.97（C-6），170.06（C-7），53.36（C-9），38.62（C-10），24.73（C-11），21.17（C-12），23.28（C-13）。

3304A的ESI-MS（+）显示其准分子离子峰为211（M+H）+，233（M+Na）+；所以可以确定该化合物的分子量为210。化合物3304A的IR图谱显示3434 cm-1处有一吸收峰，揭示其分子结构中含有羟基、羧基或氨基活泼氢，1670、1643 cm-1为碳碳或碳氧双键的伸缩振动吸收峰。所以从IR图可看出分子结构中含有活泼氢及双键。1H-NMR谱中δ 5.82，显示可能有一个酰胺氢（NH）存在；从13C-NMR 可知化合物3304A含有11个碳原子，其中δ 170.06和166.11 可能为酰胺碳，δ 58.97和53.36则可能为酰胺羰基的α碳的化学位移。再结合其紫外光谱呈末端吸收的特点，推测3304A为由两个氨基酸组成的二酮哌嗪类化合物。

氨基酸组成的二酮哌嗪类化合物的MS2谱具有特征的碎片离子峰，可以对其结构进行鉴定[8]。化合物3304A的ESI+-MS2图显示主要有m/z 211.1、183.2、154.1、138.1、114.1、98.1、70.0 等峰。见图1。

图1 化合物3304A的ESI+-MS/MS图

m/z 98.1为脯氨酸残基的特征离子峰，m/z 70.0为脯氨酸残基断裂酰胺羰基的峰，进一步印证了脯氨酸残基的存在，m/z 114.1可能为亮氨酸或异亮氨酸残基的离子峰，m/z 183.2为母离子断裂酰胺羰基的峰。根据1H-NMR谱中δ 0.95和1.00的两个甲基氢均裂分为二重峰，可以推断另一氨基酸为亮氨酸。综合以上信息，可以确定化合物3304A为脯氨酸和亮氨酸组成的环二肽，其可能的裂解示意图见图2。

此外，查阅文献[9]显示，3304A的1H-NMR、13C-NMR数据与环（脯氨酸-亮氨酸）的1H-NMR、13C-NMR数据几乎完全一致；其比旋光度为-137.5°，和文献报道的很接近，所以确定 3304A为已知的二酮哌嗪类化合物：环（脯氨酸-亮氨酸），结构见图3。

2.2 化合物3304C的理化性质与结构鉴定

化合物3304C冷干品呈黄色粉末，易溶于甲醇、乙腈和DMSO，不溶于环己烷，微溶于水。甲醇溶液中的紫外光谱（UV）在284 nm处有最大吸收。IR在3265、2961、1689、1663、1455、750和701 cm-1处有较强吸收。1H-NMR（CDCl3，600 Mz）δ：4.27（1H，dd，J=2.4，10.2，3-H），4.07（1H，t，J=7.8，6-H），2.75~2.80（1H，m，1'a-H），3.61~3.63（1H，m，1'b-H），5.62 （1H，s，N-H），7.22~7.36（5H，m，3'、4'、5'、6'、7'-H），3.55~3.58（1H，m，1''a-H），3.64~3.67（1H，m，1''b-H），1.88~1.94（1H，m，2''a-H），2.02~2.05（1H，m，2''b-H），1.97~2.00（1H，m，3''a-H），2.31~2.35（1H，m，3''b-H）；13C-NMR（CDCl3，150 Mz）δ：169.35（C-1），56.15（C-3），165.04（C-4），59.12（C-6），36.77（C-1'），135.92（C-2'），129.08（C-3'、C-7'），129.28（C-4'、C-6'），127.55（C-5'），45.45（C-1''），22.54（C-2''），28.34（C-3''）。

3304C 的ESI-MS（+）显示该化合物的准分子离子峰为245（M+H）+。化合物3304C的IR图谱中1689、1663 cm-1为碳碳或碳氧双键的伸缩振动吸收峰；1455~1600 cm-1之间存在吸收峰，结合3061 cm-1的吸收峰，说明分子中可能存在苯环，750和701cm-1的吸收峰则说明苯环可能为单取代结构。3304C的1H-NMR谱中δ5.61，显示可能有1个酰胺氢（NH）存在，在δ7.22~7.36有5个氢，进一步印证了分子中含有一个单取代苯环。13C-NMR分析可知分子中含有14个碳原子，其中δ169.35和165.04可能为酰胺碳的化学位移，δ56.15，59.12则可能为酰胺羰基的α碳的化学位移，δ135.92，127.55，129.08×2，129.28×2则为单取代苯环碳的化学位移。根据以上信息，推测3304C也为由两个氨基酸组成的二酮哌嗪类化合物。

通过对化合物3304C的ESI+-MS2解析，确定了化合物的氨基酸组成。ESI+-MS2图显示主要有m/z 245.1、217.1、172.1、154.1、120.1、98.1、70.0等峰见图4。

图4 化合物3304C的ESI+-MS/MS图

从m/z 98.1和m/z 70.0推断其中1个氨基酸为脯氨酸；m/z 120.1可能为苯丙氨酸残基断裂酰胺羰基的离子峰，再结合m/z 154.1为分子离子峰断裂苯亚甲基的离子峰，可以推断另一氨基酸为苯丙氨酸。综合以上信息，可以确定化合物 3304C 为脯氨酸和苯丙氨酸组成的环二肽，其可能的裂解示意图见图5。

图5 化合物3304C的ESI+-MS2 主要离子峰裂解示意图

此外，文献调研[10]显示，3304C的1H-NMR、13C-NMR数据与环（脯氨酸-苯丙氨酸）的1H-NMR、13C-NMR数据几乎完全一致；进一步验证了ESI+-MS2解析的结果，其平面结构见图6。

图 6化合物3304C的平面结构

2.3 化合物3304A和3304C的VEGFR2-CD抑制活性

应用ELISA法检测3304A和3304C对VEGFR2-CD的抑制活性，3304A的抑制活性分别为：27.8%、21.9%、0、0、0、0；3304C的抑制活性分别为54.3%、19.3%、15.4%、0、0、0。由以上结果可知：3304A和 3304C均对VEGFR2-CD有一定的抑制活性，而且其抑制活性呈浓度依赖性。

3 讨论

二酮哌嗪类化合物也称二氧哌嗪，包括2，5-二酮哌嗪和2，3-二酮哌嗪。环二肽类化合物就属于2，5-二酮哌嗪类，具有多种生物活性，包括抑菌、抗肿瘤、抗动脉硬化、保护神经元、改善脑功能以及脱瘾、解毒等[11-12]，是自然界中最小的环肽。3304A为环（脯氨酸-亮氨酸），3304C为环（脯氨酸-苯丙氨酸）。文献报道[13-14]，环（脯氨酸-亮氨酸）和环（脯氨酸-苯丙氨酸）对温敏型小鼠乳腺癌细胞tsFT210具有一定的抑制活性，其中环（脯氨酸-亮氨酸）在500 μg/mL浓度下，抑制率为43.89%，环（脯氨酸-苯丙氨酸）在5 μg/mL浓度下，抑制率为13.1%。本文首次报道了环（脯氨酸-亮氨酸）和环（脯氨酸-苯丙氨酸）的VEGFR2-CD抑制活性。根据李德海等[13]的研究报道，该类化合物的体外抗肿瘤活性在5~100 μg/mL范围内不具有浓度依赖性，所以对其抗肿瘤作用和VEGFR2-CD抑制活性之间的关系还需进一步研究，但3304A和3304C的VEGFR2-CD抑制活性结果可以对二酮哌嗪类化合物的抗肿瘤机制研究提供一些启示。

链霉菌作为抗生素的主要来源，许多重要的临床抗生素均来源于链霉菌（如链霉素、红霉素、阿霉素、丝裂霉素、林可霉素、四环素等），一直是微生物药物学家关注的重点[15]。第一个来自链霉菌的抗生素是美国Waksman研究组1942年发现的链丝菌素[16]，随后该研究组在1944年又从链霉菌中发现了具有历史意义的链霉素，该研究成果极大地激发了科学家从链霉菌属微生物中寻找新抗生素的兴趣[17]。链霉菌属来源的抗生素数量在20世纪70年代达到最高峰，之后每年从链霉菌属发现的新抗生素逐渐减少，尤其是进入20世纪90年代后，来自于链霉菌的抗生素急剧减少，发现新的抗生素越来越难。但Watve等[18]研究认为，链霉菌属的抗生素产生潜力还远未挖掘出来，目前所发现的抗生素仅占3%左右，并认为抗生素发现的下降是由于筛选方法不足造成的，采用经典的筛选方法会重复发现已知的抗生素。如何挖掘链霉菌属这一抗生素资源宝库，除了开发新的筛选模型之外，另外一个需要重点关注的是已知抗生素的早期排重，如环二肽类化合物就可以用MS2结合数据库进行早期微量鉴别，微量在线分析水平（LC-MS、LC-MSn、LC-NMR等）的提升也有助于化合物的早期排重。

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（收稿日期：2014-03-06本文编辑：程铭）

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（收稿日期：2014-03-06本文编辑：程铭）