龙葵多糖对荷瘤小鼠脾指数和胸腺指数的影响

王向涛，孙桂超，徐昶儒，韩 磊，刘日嘉，张 鑫，袁洪亮，肖 爽，苏怡君

(哈尔滨商业大学生命科学与环境科学研究中心，哈尔滨 150076)

研究表明多糖类成分具有较好的免疫促进作用，其在抗肿瘤、抗病毒、抗感染等方面表现出了较好的疗效[1].多糖不仅具有抗肿瘤药理作用，而且还可以降低化疗药物的不良反应，在临床上成为良好的化疗辅助用药，对化疗疗效的提高及降低不良反应具有较大的帮助[2-5].

龙葵(Solanum nigrum L.)为茄科一年至多年生草本植物, 全草均可入药[6]，具有抗肿瘤、抑菌、抗病毒作用，同时对神经系统和心血管系统等方面具有较好的作用，得到了国内外学者的广泛关注[7-10].据文献报道龙葵中的生物碱类成分可以抑制肿瘤细胞增殖，促进其凋亡等作用，而关于龙葵多糖是否对肿瘤具有一定的治疗作用，尚未见报道，因此本文主要初步观察了龙葵多糖对肿瘤的治疗作用.

本文主要观察了龙葵多糖(LP)的体内外抗肿瘤作用，并观察了其对免疫系统的初步影响.通过本研究为龙葵多糖的抗肿瘤作用的开发提供实验基础.

1 实验材料

1.1 药物

龙葵粗多糖：哈尔滨商业大学药物研究所提供；黄芪多糖(APS)：黑龙江省生物制药一厂提供(批号：201301)；5-Fu：上海旭东海普药业有限公司(批号：201211)；阿霉素：浙江海正药业股份有限公司(批号：201304).

1.2 实验动物及瘤株

昆明种小鼠，体重(20±2.0)g，雌雄各半，购自黑龙江中医药大学动物中心提供；瘤株：S180(肉瘤)、H22(肝癌)购自哈医大学附属肿瘤医院肿瘤研究所；HepG-2和SGC-7901细胞由哈尔滨商业大学药物研究所冻存复苏.

1.3 实验试剂

RPMI-1640购自Hyclone公司，胎牛血清购自杭州四季青生物有限公司；叠氮钠(NaN3)、MTT(噻唑蓝)、DMSO(二甲基亚砜)、胰蛋白酶购自Sigma公司；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠等试剂均为分析纯.

1.4 实验仪器

低速离心机 北京医用离心机厂(LD4-2A型)；

超净工作台 苏州净化设备厂；

电热恒温水浴锅 北京长安科学仪器厂；

二氧化碳培养箱 美国NBS公司(CO-150型)；

倒置显微镜 日本OLYMPUS公司；

酶标仪 美国伯乐公司(680型)；

2 实验方法

2.1 实验分组

小鼠随机分成6组：1)阴性对照组，2)阳性对照组(黄芪多糖组)，3)阳性对照组(5-Fu组)，4)龙葵多糖高剂量组，5)龙葵多糖中剂量组，6)龙葵多糖低剂量组.

2.2 MTT比色法测定龙葵多糖体外对HepG-2和SGC-7901两种肿瘤细胞的细胞毒作用

取对数生长期的细胞调整细胞浓度为1×104个/mL，接种于96孔培养板(100μL/孔)，二氧化碳培养箱中培养24 h，24 h后，分别加入5个浓度的龙葵多糖及5个浓度的阳性药5-Fu，于二氧化碳培养箱中培养72 h.72 h后，吸弃细胞培养基，每孔加入质量浓度为1 mg/mL的MTT 150 μL，于二氧化碳培养箱中作用4 h.4 h后，弃去MTT，各孔分别加入150 μL DMSO，摇匀，于570 nm波长下测定光密度(OD).根据测定的吸光度值计算抑制率并计算IC50.

抑制率(%)=(对照组吸光度值-实验组吸光度值/对照组吸光度值)×100%

2.3 龙葵多糖对S180实体瘤的抑制作用

生长良好的S180荷瘤小鼠颈椎脱臼处死，腹部皮肤消毒后，用注射器无菌条件下小鼠腹腔抽取S180腹水，放入无菌容器内，腹水应为乳白色，如有红色的溶血不可用.另取一滴腹水细胞计数板计数，制片，瑞氏染色，并进行细胞计数，其中癌细胞数为97%以上方可使用.按生理盐水：腹水为4∶1的溶液稀释，选用昆明种小鼠，体重(20±2 g)，雌雄各半，于小鼠右肢腋下接种，0.2 mL/只.

将接种后的小鼠60只，随机分为6组，分别为LP高、中、低剂量组，阳性对照组(黄芪多糖对照组、5-Fu对照组)及阴性对照组.接种24 h后LP组分别以125、62.5、31.25 mg/kg三个剂量给药，黄芪多糖对照组给药剂量为100 mg/kg，5-Fu对照组给药剂量为25 mg/kg，阴性对照组给相同体积的生理盐水.腹腔给药，每日1次，连续7 d.停药次日处死，称体重，取出瘤块称重，按如下公式计算抑制率，并观察药效与剂量间的关系.本实验重复进行3次.

瘤重抑制率=

2.4 龙葵多糖对小鼠移植肿瘤H22的生命延长作用

实验步骤基本同2.3，区别在于造模时采用腹腔注射，而不是腋下注射.生命延长率计算公式如下：

生命延长率=

2.5 龙葵多糖对S180实体瘤小鼠脾指数和胸腺指数的影响

荷瘤小鼠造模方法同2.3，将造模后的小鼠随机分为6组，分别为LP高、中、低剂量组，阳性对照组(黄芪多糖对照组、5-Fu对照组)及阴性对照组.接种24 h后LP以125 mg/kg、62.5 mg/kg、31.25 mg/kg三个剂量给药，黄芪对照组剂量100 mg/kg，5-Fu对照组剂量25 mg/kg，阴性对照组给相同体积的生理盐水.腹腔给药，每日给药1次，连续给药7d.停药次日处死，称体重，取脾、胸腺，用电子天平称质量，按下列公式计算脾脏指数、胸腺指数.本实验重复进行三次.

脏器指数=脏器质量(mg)/体质量(g)

2.6 数据处理

结果以x±S表示，组间采用t-test进行方差分析和差异显著性分析.

3 实验结果

3.1 MTT比色法测定龙葵多糖的体外对HepG-2和SGC-7901两种肿瘤细胞的直接抑制作用

结果如表1所示，龙葵多糖对HepG-2和SGC-7901均有一定的抑制作用，但抑制作用较弱.

表1龙葵多糖对HepG-2和SGC-7901肿瘤细胞半数抑制浓度

化合物IC50/(μg·mL-1)HepG-2SGC-7901LP189.60186.56CAM1.0319.19

3.2 龙葵多糖对S180小鼠瘤重的影响

如表2所示，龙葵多糖各剂量组S180小鼠平均瘤重均明显低于生理盐水组(P<0.01)，中剂量组抑制率可达40.13%，但高剂量抑瘤率不及中剂量组.

表2龙葵多糖对S180小鼠瘤重的影响

组别剂量/ (mg·kg-1)n质量/g开始结束开始结束瘤重/g抑制率/%Control—121019.54±1.0723.16±1.962.10±0.40 —5-Fu25121120.30±0.9320.47±2.080.90±0.25∗∗57.07APS100121019.13±0.8523.46±1.681.43±0.28∗∗32.21LP125121219.87±0.7126.32±2.401.45±0.31∗∗31.3462.5121219.85±0.5425.43±1.911.26±0.26∗∗40.1331.25121019.31±0.3524.58±2.201.51±0.21∗∗28.20

*P<0.05，**P<0.01 vs control

3.3 龙葵多糖对H22小鼠生存时间的影响

如表3所示，龙葵多糖各剂量组均能明显延长H22小鼠生存时间(P<0.05，P<0.01)，其中剂量组生命延长率可达88.87%，明显优于APS对照组(P<0.05)，但高剂量组作用不及中剂量组.

3.4 龙葵多糖对S180小鼠脾指数及胸腺指数的影响

如表4所示，龙葵多糖各剂量组均可显著提高荷瘤小鼠的胸腺指数和脾指数(P<0.05或P<0.01).

表3龙葵多糖对H22荷瘤小鼠生存时间的影响

组别剂量/(mg·kg-1)n开始结束平均生存天数/d生命延长率/%空白—121011.18±2.04—5-Fu25121224.10±3.57∗∗107.53APS100121016.00±2.20∗∗43.09LP125121221.10±3.78∗∗78.7662.5121221.45±3.47∗∗88.8731.25121115.20±2.70∗∗42.89

*P<0.05，**P<0.01 vs control

表4龙葵多糖对S180荷瘤小鼠脾指数和胸腺指数作用

组别剂量/ (mg·kg-1)n开始结束 结束时体重/g胸腺指数/(mg·g-1)脾指数/(mg·g-1)Control—121023.16±1.962.15±0.823.98±0.655-Fu25121120.47±2.081.82±0.623.25±1.13APS100121023.46±1.683.00±0.72∗5.86±0.87∗∗LP125121226.32±2.404.28±0.90∗6.72±1.37∗∗62.5121225.43±1.913.83±0.74∗∗6.05±0.81∗∗31.25121024.58±2.202.98±0.70∗5.84±1.04∗

*P<0.05，**P<0.01 vs control

4 讨 论

本实验对龙葵多糖成分体内外抗肿瘤药效进行了研究.体外实验采用MTT法观察了龙葵多糖对HepG-2和SGC-7901两种人体肿瘤细胞的生长抑制作用.结果显示龙葵多糖对两种肿瘤细胞的IC50分别为189.60 μg/mL和186.56 μg/mL，明显高于中药提取物细胞毒作用的评价标准(10 μg/mL)，说明龙葵多糖对HepG-2和SGC-7901细胞的细胞毒性较弱.

抑瘤率和生命延长率是评估药物在药效学研究方面的基础性指标，减缓肿瘤的生长速度,甚至使瘤体缩小，是抗肿瘤药物是否有效的重要指标，生命延长率是验证药物是否有效的药效学整体评估指标.体内实验主要观察了龙葵多糖对S180实体瘤的抑制作用(以抑瘤率为指标)以及对H22腹水癌小鼠生存时间的延长作用(以生命延长率为指标).结果表明龙葵多糖表现出良好的抑瘤效果和生命延长效果.其中龙葵多糖中剂量对S180小鼠的抑瘤率最大，达到了40.13%.并且在H22小鼠生存时间的实验中，我们发现高剂量组的荷瘤小鼠生存时间反而下降，就抑瘤率以及生存时间而言高剂量组小鼠的药物效果低于其他剂量组，可能是因为多糖类成分比较粘稠，高浓度龙葵多糖体内吸收不如其他剂量组造成的.

脾脏和胸腺是人体重要的免疫器官，其中脾脏是免疫细胞定居的场所，也是免疫应答的场所；胸腺是T细胞发育的主要场所.机体发生超敏反应的同时，其质量会增加，因此脾指数和胸腺指数可作为评估药物对免疫器官的抑制作用的基础指标[11].研究发现，LP对荷瘤小鼠免疫器官具有保护作用，与阴性对照组比较胸腺指数和脾指数两项指标均有不同程度的增加，中高剂量组作用显著(P<0.05或P<0.01).

肿瘤的发生发展与机体免疫系统有着密切的关系，机体免疫机能的降低有利于肿瘤的形成和发展，而癌症患者常有免疫机能低下及免疫器官萎缩[12].特别是化疗药物的应用，常引起机体免疫机能严重下降.而相关报道显示，多糖类成分的抗肿瘤药物均具有提高免疫能力和保护脾脏的作用[13-18].本研究结果提示，龙葵多糖抗肿瘤作用并非直接杀伤肿瘤细胞，而可能是通过其强大的免疫调节作用实现的.龙葵多糖类成分对肿瘤病人生命延长和提高免疫力方面有很好的应用前景.

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