丹参酚酸注射液对室间隔缺损模型家兔血清候选蛋白标志物FN及心房肌细胞Cx43蛋白的表达影响研究

潘国洪，谭秦东

（1.汉川市人民医院药剂科，湖北汉川432300；2.中南大学湘雅附一医院麻醉科，湖南长沙410008）

丹参酚酸注射液对室间隔缺损模型家兔血清候选蛋白标志物FN及心房肌细胞Cx43蛋白的表达影响研究

潘国洪1，谭秦东2

（1.汉川市人民医院药剂科，湖北汉川432300；2.中南大学湘雅附一医院麻醉科，湖南长沙410008）

目的探讨丹参酚酸注射液对室间隔缺损模型家兔血清候选蛋白标志物FN以及心房肌细胞Cx43蛋白的表达影响。方法选取家兔34只，其中24只室间隔缺损造模，造模成功19只按随机数字表达法分为2组，阴性对照组（A组）9只，给予混合饲料和纯净水饲养；丹参酚酸注射液组（B组）10只，在A组饲养的基础上，按每天剂量为150mg／kg的丹参酚酸注射液进行灌胃；未造模10只家兔作为正常对照组（C组），给予混合饲料和纯净水饲养，由家兔自行饮食。饲养8周后处死家兔，采用荧光定量PCR、免疫组化及免疫印迹法（Western blot）检测3组家兔血清中候选蛋白标志物FN和心房肌细胞Cx43蛋白表达水平。结果A组家兔血清中候选蛋白标志物FN mRNA表达水平显著高于B、C组，心房肌细胞Cx43mRNA表达水平显著低于B、C组，差异均有统计学意义（P＜0.01）；B组家兔血清中候选蛋白标志物FN mRNA和心房肌细胞Cx43mRNA的表达水平与C组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；A组家兔血清中候选蛋白标志物FN蛋白表达水平显著高于B、C组，心房肌细胞Cx43蛋白表达水平显著低于B、C组，差异均有统计学意义（P＜0.01）；B组家兔血清中候选蛋白标志物FN和心房肌细胞Cx43的蛋白表达水平与C组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论丹参酚酸注射液能够明显降低室间隔缺损模型家兔血清中候选蛋白标志物FN的表达，升高心房肌细胞Cx43蛋白的表达，改善室间隔缺损家兔心脏功能，对临床具有指导意义，值得临床推广。

丹参酚酸注射液；室间隔缺损；候选蛋白标志物FN；心房肌细胞Cx43

室间隔缺损（ventricular septal defect，VSD）是由于左、右心室之间存在一个直接开口，而引起的一种心室水平的左向右分流的先天性心脏病［1］。本病因大、中、小不同缺损程度而表现出不同的临床表现，小型室间隔缺损收缩期左向右分流不大，患者临床表现较轻，甚至无症状；中型室间隔缺损左、右室之间分流较大，部分患者可表现为劳力性呼吸困难；大型室间隔缺损，收缩期左右室之间无压力差，左向右分流大，表现为皮肤青紫，严重呼吸困难，此类患者生存期较短［2］。本病多发于儿童，据调查统计，从1990年的0.13‰上升至2010年的0.42‰，并有逐年上升趋势［3］。随着医疗技术的发展，本病人们更加重视疾病防治及预后，现代医学多采取手术修复缺损为主要治疗方法，但手术后常常并发心律不齐、心肌收缩力下降等心脏疾。研究发现［4］，丹参酚酸注射液能够提高室间隔缺损心脏功能，改善临床症状，为了增强疗效，改善症状、缓解患者痛苦，改善其预后，笔者做了有关研究。通过观察室间隔缺损模型家兔血清候选蛋白标志物FN以及心房肌细胞Cx43蛋白的表达，来探究丹参酚酸注射液对室间隔缺损的治疗效果，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 6个月龄家兔34只，体质量1.74～2.16 kg，家兔购于中国科学院上海动物中心（合格证号：D20021024），实验开始前在安静、室温、避强光的环境中饲养1周；丹参酚酸注射液（天津天士力之骄药业有限公司，国药准字Z20110011）；兔抗人FN抗体、兔抗人Cx43抗体和ECL化学发光液购于Cell Signalling Technology公司，本实验遵循《实验动物保护条例》，符合3R原则。

1.2 室间隔缺损家兔模型建立 采用改良式Synhorst法建立室间隔缺损模型家兔。全身麻醉理想后，备皮消毒，于胸骨正中切开皮肤，逐层分离肌肉，钢锯沿胸骨正中线锯开胸骨，撑开胸腔，暴露心脏，剪开心包，用4号可吸收缝合线于右心耳处作一荷包缝合，用无损伤钳夹住心耳，剪刀剪开心耳，经切口将定制的室间隔穿刺器放入右心房，然后快速穿刺进入右心室，迅速收紧荷包。固定心脏后，穿刺器垂直于室间隔快速刺入左心室，拔出穿刺器的内芯，将外环置于室间隔上。当于右心室壁扪及颤动后缓慢退出穿刺器，结扎荷包。术后予以抗感染对症治疗。1个月后行心脏彩超检查，若有自左向右血液分流存在时，证明室间隔缺损模型家兔造模成功。

1.3 分组和用药 造模24只家兔，其中1只家兔因麻醉死亡，2只因术中出血死亡，2只术后心脏衰竭死亡，19只成功造模的家兔随机分为2组，阴性对照组（A组）9只，给予以混合饲料和纯净水饲养；丹参酚酸注射液（B组）10只，在A组饲养的基础上，按每天剂量为150mg／kg的丹参酚酸注射液进行灌胃；正常对照组（C组）10只，未造模的家兔，给予以混合饲料和纯净水饲养，由家兔自行饮食。3组家兔均在适宜的相同环境下饲养8周。

1.4 血清及心房肌样本采集 3组家兔饲养8周后，于清晨空腹抽取家兔耳缘静脉血3mL，加入含EDTA-K2抗凝剂的真空管中混匀，放入4℃冰箱内2 h，4000 r／min离心5min，吸取50 μL血清置于0.5mL离心管中，－80℃环境下保存。抽取耳缘静脉血后处死家兔，迅速取出心脏，浸泡于10%中性福尔马林溶液中，固定24 h。经常规脱水、包埋、切片、HE染色，光镜下观察，每张切片选取3个视野，测量的数值用于统计分析。

1.5 血清候选蛋白标志物FN以及心房肌细胞Cx43蛋白的表达

1.5.1 免疫组化法：采集的标本按常规脱蜡，采用3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶，PBS缓冲液冲洗1次，枸橼酸盐缓冲液热修复后，PBS冲洗1次。按照试剂盒说明进行非生物素二步法检测，DAB-H2O2显色，Mayer苏木素复染，采用Image-Pro Plus 6.0软件分别检测每个视野ASMC的截面积、累计光密度值，再将累计光密度值／截面积得出平均光密度值，每张切片选取5个视野，取平均值用于统计分析。

1.5.2 Western blot法：分别选取家兔血清样本和心房肌组织样本，充分匀浆，加裂解液200μL，13000 r／min，4℃，离心15min，取上清，按BCA蛋白定量试剂盒说明书进行蛋白定量，每孔取20μg总蛋白加入上样缓冲液，煮沸5 min变性后，10% SDS-PAGE电泳，90 V恒压下电泳至溴酚蓝接近分离胶顶端，然后120 V恒压电泳至溴酚蓝刚出胶底部。100mA恒流电转2 h。5%脱脂奶粉室温封闭1 h，继而加入兔抗人FN抗体、兔抗人Cx43抗体（按1∶1000稀释）或抗β-actin（1∶2000稀释），置于4℃环境中过夜。PBST洗涤3次，每次10min，加入二抗，温室孵育2 h。再次用PBST洗涤3次，每次10min。将PVDF膜ECL显色，在暗室中将PBVF曝光于X光片中，用凝胶成像系统扫描分析结果。

1.5.3 荧光定量PCR法：用超纯RNA提取试剂盒提取组织样本中总RNA。实验操作按产品说明书进行，用紫外分光光度法测定RNA的含量。按逆转录试剂盒操作说明合成cDNA，将RNA模板、引物、5×RT Buffer和RNase-free Water溶解并置于冰上备用。将2μL Primermix试剂和10μL消化后RNA分别加入20μL反应体系的第一部分，混匀。95℃孵育5min，迅速冰浴2min，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。继续向以上反应管中加入4μL 5×RT Buffer、2μL 0.1M DTT、1μL 10 mM dNTPEach和1μLHiFi-MMLV Enzyme Mix试剂，轻轻吸打混匀，37℃孵育50min，70°保温10min。利用FN和Cx43及β-action基因特异引物和SYBR Green荧光染料在PCR仪上进行实时荧光定量扩增。引物序列见表1。PCR产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳后，溴化乙啶染色，通过成像分析scion软件计算和比较FN和Cx43产物条带的吸光度值，并与β-action条带光密度值比较，计算出FN和Cx43 mRNA表达含量（见表1）。

表1 目的基因的RT-PCR引物序列Tab.1 Primer sequence of target gene by RT-PCR

1.6 统计学方法 采用统计学软件SPSS 17.0进行统计学分析，正态计量资料用“±s”表示，组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组家兔FN及Cx43mRNA的相对含量比较 阴性对照组家兔血清候选蛋白标志物FN和心房肌细胞Cx43mRNA相对含量显著高于B组和C组，差异有统计学意义（P＜0.01）；B组家兔经丹参酚酸注射液喂养后，血清候选蛋白标志物FN和心房肌细胞Cx43mRNA相对含量有所改善，但与C组比较存在一定差异，差异有统计学意义（P＜0.05，见表2）。

表2 3组家兔FN及Cx43mRNA的相对含量比较情况Tab.2 Comparison of the relative content of FN and Cx43 mRNA

2.2 3组家兔FN及Cx43蛋白平均光密度值及免疫组化结果 与C组比较，A、B 2组血清候选蛋白标志物FN蛋白表达水平显著增高（P＜0.05），心房肌细胞Cx43的蛋白表达显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与A组比较，B组血清候选蛋白标志物FN的蛋白表达显著降低，心房肌细胞Cx43的蛋白表达显著增高（P＜0.05，见表3，图1）。

表3 3组家兔FN及Cx43蛋白平均光密度值比较Tab.3 Comparison of FN and Cx43 protein in the average optical density value

图1 家兔FN及Cx43蛋白表达（DAB，×400）Fig.1 Expression of FN and Cx43 protein（DAB，×400）

2.3 3组家兔FN及Cx43蛋白的相对含量比较 A组家兔血清候选蛋白标志物FN和心房肌细胞Cx43蛋白表达显著高于B组和C组，差异有统计学意义（P＜0.01）；经丹参酚酸注射液喂养B组家兔血清候选蛋白标志物FN和心房肌细胞Cx43蛋白表达与A相比明显改善，但与C组比较存在一定差异，差异有统计学意义（P＜0.05，见表4，图2）。

表4 3组家兔FN及Cx43蛋白的相对含量比较情况Tab.4 Comparison of the relative content of FN and Cx43 protein

图2 家兔血清候选蛋白标志物FN和心房肌细胞Cx43的蛋白电泳图1，2：正常对照组（C组）；3，4：阴性对照组（A组）；5，6：丹参酚酸注射液（B组）Fig.2 Serum protein electrophoresismap of candidate protein markers of FN and Cx43 in the atrialmuscle cells1，2：normal control group（group C）；3，4：negative control group（group A）；5，6：salvianolate injection（group B）

3 讨论

室间隔缺损是常见的先天性心脏病，仅次于房间隔缺损占第二位，是新生儿非感染性死亡的重要因素，在先天性缺陷中具有重要地位［5］。目前临床中主要以手术修补缺损为主要治疗方法，但术后易导致其他心脏疾病，给患者生活治疗及患者家庭经济带来严重影响［6］。探究室间隔缺损的发病因素，致病机理对提高室间隔缺损的预防和诊疗措施，改善我国国民身体素质，提高国民生活质量有着重要意义。现代医学对于室间隔缺损的病因和发病机制尚不明确。随着蛋白组学技术的发展，从蛋白质组学的角度来研究室间隔缺损的发生发展，为揭示室间隔缺损的病因病机提供一条新的思路［7］。

血清候选蛋白标志物FN是有血管、肝脏和血管平滑肌产生的细胞外基质中的细胞黏附分子，对组织细胞形态的支持、连接和维持起着重要作用，并对细胞的黏附、增殖、分化具有调控作用，还能促进离子信号交换和损伤修复［8］。FN是心脏发育必需的调控因子，心脏发育过程中，心肌细胞的发育、分化、迁移都离不开FN的调控作用；当心脏神经嵴细胞迁移受阻，影响心脏神经嵴的发育，从而导致室间隔缺损的发生［7］。研究发现［9］，在胚胎发育、纤维化以及创伤愈合的过程中，血清候选蛋白标志物FN呈现出高度表达，本研究结果显示，与正常家兔相比，室间隔缺损模型家兔血清候选蛋白标志物FN表达明显增高，说明室间隔缺损刺激机体对缺损的修复，从而导致调控因子FN的高度表达。心房肌细胞Cx43蛋白是心脏连接蛋白，若Cx43基因产生异常，常引起先天的心脏病的发生［10］。Cx43组成的连接通道能够传递离子和小分子代谢产物，并且是心肌电耦的基础物质，对于心肌的连接具有重要作用，若连接通道受损，连接蛋白发生改变，则导致心血管疾病的发生［11-12］。本研究结果示，正常家兔心房肌细胞Cx43蛋白表达明显高于室间隔缺损模型家兔，说明室间隔缺损模型家兔连接通道遭到破坏，心电传播功能受损，无法直接传递离子和小分子代谢产物，严重影响心脏的收缩功能。丹参酚酸注射液主要成分为丹参酚，丹参酚能够改善冠状动脉血流量，促进心肌细胞再生，缺损的修复，能够有效地促进室间隔缺损的修复［13］。本研究结果示，经过丹参酚酸注射液处理的室间隔模型家兔血清候选蛋白标志物FN和心房肌细胞Cx43蛋白均明显改善，说明丹参酚酸注射液能够促进心房肌细胞Cx43蛋白表达，改善连接通道，恢复离子和小分子代谢的传递功能，促进室间隔缺损的修复，下调血清候选蛋白标志物FN的表达，改善心脏收缩功能［14］。

综上所述，丹参酚酸注射液能够促进心房肌细胞Cx43蛋白表达，改善Cx43间隙连接通道功能，促进室间隔缺损的修复，从而下调血清候选蛋白标志物FN的表达，改善心肌的收缩功能。提高临床治疗效果，改善患者预后，对临床具有重要的指导意义。

［1］ 陈志玫，杜明昭.小儿室间隔缺损的治疗策略［J］.中国优生与遗传杂志，2012，20（9）：6，14.

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（编校：王俨俨，谭玲）

Effect of salvianolate injection on expressions of serum candidate protein markers FN and Cx43 protein in atrialmyocytes of ventricular septal defectmodel rabbit

PAN Guo-hong1，Tan Qin-dong2

（1.Department of Pharmacy，Hanchuan People Hospital，Hanchuan 432300，China；2.Department of Anesthesiology，Xiangya Hospital，Central South University，Changsha 410008，China）

ObjectiveTo investigate the effect of salvianolate injection on expressions of serum candidate protein markers FN and Cx43 protein in atrialmyocytes of ventricular septal defectmodel rabbit.Methods34 rabbits were selected as objects，of which 19 rabbits were modeled successfully after ventricular septal defectmodel constructed in 24 rabbits.19 rabbitswere randomly divided into two groups according to random number table：the negative control group（group A，n＝9）treated withmixed feed and purified water；salvianolate injection group（group B，n＝10）treated with 150mg／（kg·d）salvianolate injection by oral gavage on the basis of group A.10 rabbitswithoutmodeling treated with naturalmixed feed and purified water and were as a normal control group（group C）.Rabbitswere sacrificed after8 weeks.Levels of serum candidate proteinmarkers FN and Cx43 protein in atrial myocytes of three groups were detected by fluorescence quantitative PCR，immunohistochemistry and immunoblotting（Western blot）.ResultsSerum candidate protein markers FNmRNA levels of group A were higher than that in group B and C，levels of Cx43 proteinmRNA in atrialmyocytes of group A were lower than that in group B and C，and the differenceswere statistically significant（P＜0.01）；the difference of serum candidate proteinmarkers FN mRNA levels and levels of Cx43 proteinmRNA in atrialmyocytes between group B and group Cwere significant（P＜0.05）；Serum candidate protein markers FN protein levels of group A were higher than that in group B and C，levels of Cx43 protein in atrialmyocytes of group A were lower than that in group B and C，and the differenceswere statistically significant（P＜0.01）；the difference of serum candidate proteinmarkers FN protein levels and levels of Cx43 protein in atrialmyocytes between group B and group Cwere significant（P＜0.05）.ConclusionSalvianolate injection can significantly reduce the expression of serum candidate protein markers FN，increase expression of Cx43 protein in atrialmyocytes，and improve cardiac function in ventricular septal defectmodel rabbit，which has clinical significance.

book=24,ebook=29

salvianolate injection；ventricular septal defect；candidate protein markers FN；Cx43 protein in atrialmyocytes

R363

A

1005－1678（2014）09－0023－04

潘国洪，男，本科，副主任药师，研究方向：临床药学，E-mail：pangh011＠163.com。