新型STAT3抑制剂齐福斯尼对多发性骨髓瘤细胞凋亡及细胞周期的影响

李雪琴，张华，陈丽娟

（1.河南郑州市儿童医院儿科，河南郑州450053；2.郑州市骨科医院脊柱三科，河南郑州450003；3.南京医科大学基础医学，江苏南京210029）

新型STAT3抑制剂齐福斯尼对多发性骨髓瘤细胞凋亡及细胞周期的影响

李雪琴1，张华2，陈丽娟3

（1.河南郑州市儿童医院儿科，河南郑州450053；2.郑州市骨科医院脊柱三科，河南郑州450003；3.南京医科大学基础医学，江苏南京210029）

目的探讨新型信号转导与转录激活因子-3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）抑制剂齐福斯尼（kifocitanib，KIF）对多发性骨髓瘤（multiplemyeloma，MM）细胞系OPM2和U266凋亡及细胞周期的影响。方法采用台盼蓝染色法，检测KIF对OPM2、U266细胞的存活率及增殖的影响；Annexin V／PI双染色法和流式细胞仪检测细胞凋亡率；流式细胞仪检测细胞周期。结果KIF对OPM2、U266细胞具有明显的生长抑制作用，并且呈现剂量依赖性和时间依赖性抑制作用，KIF使OPM2、U266细胞停滞于G0／G1期，具有诱导细胞凋亡的作用。结论KIF阻滞MM细胞增殖，诱导细胞凋亡，具有抗MM的活性。

STAT3抑制剂；多发性骨髓瘤；细胞凋亡；细胞周期

多发性骨髓瘤（multiplemyeloma，MM）是发生于B淋巴细胞的恶性浆细胞克隆增生性疾病，我国发病率约1／10万，多好发于中老年人群，但近年来数据统计，其有发病率增高及发病年龄提前的趋势［1］。目前，临床治疗中多以细胞毒性药物、蛋白酶体抑制剂药物、免疫调节药物或糖皮质激素类药物进行干预，虽有效地提高了患者的生存期，但药物的耐药性及其毒副作用等限制了患者的依从性［2-3］。研究显示，信号转导与转录激活因子-3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）在MM中处于异常高表达和过度活化状态［4-5］，因此以STAT3为靶点进行药物干预将是抗MM研发的新方向。本研究以人MM细胞为实验对象，探讨新型STAT3抑制剂齐福斯尼（kifocitanib，KIF）对MM细胞凋亡及周期的影响。

1 材料与方法

1.1 主要实验试剂与仪器 KIF（分子量：336.15），英国Maybrige化学试剂公司生产；胎牛血清SH30396，RPMI-1640培养基，IMDM培养基，美国HyClone公司生产；碘化丙啶（propidium iodide，PI），美国Sigma公司生产；Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒，美国Bio Vision，Inc公司生产。

流式细胞仪（EPICS®ALTRATM），美国贝克曼库尔特公司生产；酶标仪（SpectraMax M5），美国biotek公司生产；细胞计数仪（Bechman Counter Z1），美国Thermo公司。

1.2 人多发性骨髓瘤细胞培养 人多发性骨髓瘤细胞株OPM2、U266由美国多伦多大学癌症研究所提供。细胞常规培养于RPMI-1640培养基中，置含5%CO2，37℃的细胞培养箱中常规传代培养，取处于对数生长期的细胞用于实验。以OPM2、U266拒染细胞作为有活力细胞，在其比例达90%以上时进行下述实验。

1.3 人多发性骨髓瘤细胞体外增殖试验 将OPM2，U266细胞培养至对数生长期，1000 r／min离心5 min，加入新鲜培养液，计数稀释到1.5×105个／mL，吹打混匀后以终体积0.1 mL接种于96孔培养板内，KIF药物母液用IMDM培养基稀释，分别按药物浓度梯度0、5、10、15、20、30μM加KIF于96孔板内，每个浓度梯度6个孔，置5%CO2、37℃的培养箱中培养，分别在24、48、72 h将孔板内细胞液吹打混匀，采用台盼蓝染色法，计数存活细胞数，结果用Excel软件分析作图。

1.4 凋亡分析 对数生长的OPM2、U266细胞以6×105个／mL浓度、终体积0.1mL接种于24孔培养板内，接种6个孔，加入0、20μM KIF并置于5%CO2、37℃的培养箱中常规培养24 h。1000 r／min离心5min，回收细胞，PBS清洗细胞2次后，采用Annexin V／PI双染色法，100μL的Annexin V-FITC buffer重悬细胞震荡后，再分别加Annexin V-FITC和PI混合液1.25μL（两者等比例浓度混匀后一起加入），再加入300μL Annexin V-FITC buffer终止反应。流式细胞仪进行检测。

1.5 细胞周期分析 对数生长的OPM2、U266细胞以1× 106个／mL浓度接种于24孔培养板，终体积为1mL，以0、2.5、5、10μM的药物浓度梯度作用24 h，每个浓度梯度6个孔。1000 r／min离心收集细胞，PBS清洗1遍后，用75%的4℃预冷乙醇固定，存放于－20℃冰箱。检测当天，1000 r／min离心2 min去除乙醇，PBS清洗2次。加预冷的PBS 0.5 mL将细胞重悬，加入5 μL 10mg／mL的RnaseA，室温条件下，置暗处反应30min后，再加入终浓度为50μg／mL的PI，4℃避光30min，以流式细胞仪检测，结果用Cell Quest软件分析。

1.6 统计学方法 采用SPSS 13.0统计学软件进行实验数据分析，正态计量数据用“±s”表示，正态资料组间比较采用t检验，样本率的比较采用卡方检验分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 KIF对MM细胞体外增殖的影响 KIF对OPM2、U266细胞株体外增殖的剂量及时间依赖性影响研究结果显示，经过不同浓度的KIF作用24 h后，OPM2、U266细胞存活率呈现不同程度的下降，在10μM浓度时，OPM2、U266细胞的存活率分别为66%、60%，在30μM浓度时，OPM2、U266细胞的存活率分别为35%、29%（见图1）。

图1 KIF作用24 h对MM细胞体外增殖的剂量依赖性抑制作用Fig.1 Dose-dependent inhibitory effects of KIF on MM cell proliferation in vitro

KIF 10μM作用72 h后细胞存活率结果发现，在KIF作用72 h后，OPM2、U266细胞存活率由24 h时的66%、60%分别下降至11%、12%，见图2。说明KIF对OPM2、U266细胞具有明显的生长抑制作用，并且呈现剂量依赖性和时间依赖性抑制作用。

图2 10μM KIF对MM细胞体外增殖的时间依赖性抑制作用Fig.2 Time-dependent inhibitory effects of10μM KIF on MM cell proliferation in vitro

2.2 KIF对MM细胞凋亡的影响 流式细胞检测结果显示，MM细胞（OPM2、U266）在经KIF 20μM作用24 h后，KIF组的U266的早期凋亡细胞（FITC＋／PI－，右下象限）占10.96%，高于对照组的4.23%（χ2＝6.27，P＜0.05）；同时，KIF组U266的存活细胞（FITC-／PI-，左下象限）占75.15%，明显低于对照组的89.43%（χ2＝3.72，P＜0.05）；KIF组的OPM2细胞在药物作用24 h后，凋亡细胞占3.83%，对照组为2.27%，差异不明显，但KIF组的OPM2存活细胞为72.35%，明显低于对照组的90.92%（χ2＝3.39，P＜0.05），结果说明，KIF具有诱导MM细胞凋亡的作用。另外，KIF作用后，U266和OPM2的晚期凋亡细胞（FITC＋／PI＋，右上象限）亦高于对照组（P＜0.05，见图3）。

图3 KIF对U266、OPM2细胞凋亡的影响Fig.3 Effect of KIF on U266，OPM2 cell apoptosis

2.3 KIF对MM细胞周期的影响 KIF对MM细胞周期的影响结果显示，随着KIF浓度的增加，处于G0／G1期的OPM2，U266细胞比例逐渐增加，其中OPM2细胞由对照组的58.74%（0μM）逐渐增加到81.08%（10μM）（χ2＝5.64，P＜0.05），U266细胞由对照组的49.42%（0μM）增加到67.23%（10μM）（χ2＝4.71，P＜0.05），同时，处于S期的OPM2，U266细胞比例逐渐降低，其中OPM2细胞由对照组的22.00%（0μM）减少到4.60%（10μM）（χ2＝13.50，P＜0.05）；同时，U266细胞由对照组的23.60%（0μM）减少到6.79%（10μM）（χ2＝9.83，P＜0.05）。由此可见，OPM2，U266细胞在G0／G1期所占比例随药物浓度增加而增加（见图4，5）。

图4 KIF对OPM2细胞周期的影响Fig.4 Effect of KIF on OPM2 cell cycle

图5 KIF对U266细胞周期的影响Fig.5 Effect the KIF on U266 cell cycle

3 讨论

STAT3是一类非跨膜型的酪氨酸激酶，在细胞外来信号的刺激下，通过配体与膜上受体的结合，参与细胞表面受体信号的转录和核内调控下游靶基因的转导激活。研究显示，STAT3通过上调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达量，显示出抗肿瘤细胞凋亡的生物学特性［6］。同时，其可以上调细胞周期蛋白cyclin D1、D2、D3，下调p18和p27等的表达［7-8］，缩短细胞在G1期的停滞时间，快速跨入S期，促进细胞的增殖；STAT3还可增加血管内皮生长因子［9］，缺氧诱导因子1α等的表达促进肿瘤血管的生成［10］。STAT3的这些生物学活性，使其参与到肿瘤细胞的生长、增殖、凋亡、周期等的调控，肿瘤细胞的侵袭、迁移以及肿瘤血管的生成等过程。在乳腺癌、前列腺癌等实体肿瘤以及淋巴瘤、白血病、多发性骨髓瘤等恶性血液类肿瘤中均发现STAT3过表达和过度活化［11-12］。而抑制STAT3活化的药物，在阻滞肺癌和乳腺癌等肿瘤中，表现出明显的抑制肿瘤生长的特性。另外，Jonathan.B的研究发现，在小鼠骨髓瘤细胞株中响应增加的磷酸化STAT3和上调Bcl-x1是导致地塞米松抗药性产生的原因［13］，提示STAT3的异常高表达与肿瘤的耐药密切相关。

MM属于血液系统恶性肿瘤中相对高发性疾病，其发病率已超过急性白血病，位居血液系统恶性肿瘤的第二位［14］。分子流行病学研究发现，STAT3在超过60%的原发性MM患者骨髓中呈现异常高表达状态［15］。现有的抗MM药物由于长期使用，耐药性和毒副作用较大。因此，以STAT3为靶点，采用相关抑制剂抑制MM细胞的增殖将对MM的治疗提出新的思路。目前，S31-201［16］、BP-1-102［17］、OPB-31121［18］等代表性的STAT3抑制剂已进入临床试验阶段。KIF是一种新型的具有自主知识产权的抑制STAT3的小分子活性药物，它是在计算机辅助作用下通过高通量的筛选策略从众多化合物中所筛选出来的。本研究选取MM细胞系中最具代表性OPM2和U266细胞株为研究对象，结果发现，KIF可诱导MM细胞的凋亡，这种程序性的细胞死亡有助于维持MM细胞内环境的稳定，抑制了MM细胞的增殖。进一步研究发现，KIF使多比例的MM细胞停滞在G0／G1期，这种阻滞细胞周期的作用最终影响细胞的增殖并诱导MM细胞的凋亡。本研究结果再次证实了国内学者的研究结果［19］。但在该研究中，研究者还通过体内试验发现，KIF除抑制肿瘤组织内STAT3的表达活化外，还可对cyclin D3进行抑制，从而调控细胞周期，且发现KIF对试验动物的体质量无影响，且具有较好的口服活性，KIF对MM表现出良好的体外和体内药效［19］。

综上所述，STAT3抑制剂KIF可阻滞细胞周期，使其停滞在G0／G1期，诱导细胞凋亡，从而抑制MM细胞的生长和增殖，但其具体的机制尚在研究中。KIF安全性和治疗活性的评价尚不明确，因此，其是否可成为治疗MM的候选药物，需进一步深入验证。

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（编校：王俨俨）

Effect of a novel STAT3 inhibitor，kifocitanib on multip lemyeloma cell apoptosis and cell cycle

LIXue-qin1，Zhang Hua2，CHEN Li-juan2

（1.Department of Pediatric，Children's Hospital of Zhengzhou，Zhengzhou 450053，China；2.Third Department of Spine，Zhengzhou Orthopedics 450003；3.School of Basic Medicine，Nanjing Medical University，Nanjing 210029，China）

ObjectiveTo explore the influence of the new type signal transducer and activator of transcription 3（STAT3）inhibitors kifocitanib（KIF）on apoptosis and cell cycle ofmultiplemyeloma（MM）cell OPM2 and U266.MethodsThe trypan blue stainingwas used to detect the influence of KIF on survival and proliferation of OPM2，U266 cell；Annexin V／PI double staining and flow cytometry instrument were adopted to measure the effects of KIF on apoptosis rate and cell cycle of OPM2，U266 cell.ResultsKIF inhibited the growth of OPM2，U266 cells，and presented the dose dependent and time dependent inhibition.KIFmade OPM2，U266 cells stagnate in G0／G1 phase，and induced the cell apoptosis.ConclusionKIF inhibits MM cell proliferation，induces MM cell apoptosis，and has resistance to MM cell activity.

STAT3 inhibitors；multiplemyeloma；apoptosis；cell cycle

R453.9

A

1005－1678（2014）09－0014－05

国家自然科学基金（81071946）

李雪琴，女，硕士，主治医师，研究方向：新生儿，E-mail：lxq15838348416＠163.com。