早期胃癌中原代细胞ssDNA适配子检测的临床意义

徐 攀 马 驰 张雪燕 杨晓娟 蒋 丹 聂登梅 刘 昕 韩跃武

目前胃癌临床治疗主要以手术治疗为主，根据近年来的临床调查结果显示[1-2]，中晚期胃癌患者其术后的生存状况并不理想，因此早期胃癌的诊断对患者的疗效以及术后的生存状况有着重要的意义。本研究通过建立早期胃癌原代细胞ssDNA适配子的检测方法并进行临床评价，同时对其作为诊断早期胃癌标准的诊断性能进行分析，旨在建立积极有效且适用于基层医院的检测方法，为临床早期胃癌诊断提供依据。

1 材料与方法

1.1 研究方法[3-6]

1.1.1 早期胃腺癌细胞表面特异标志物(靶物质)的捕获、分离 ①早期胃腺癌细胞表面靶物质的分离提取：采取数例早期胃腺癌组织标本，利用原代细胞分离、纯化方法及生物素——链酶亲和素磁珠方法，分离提取与生物素化的适配子特异性结合的靶物质(即膜分子标志物)。②采用层析法分离、纯化得到目标靶物质——分子标志物：首先对上一步提取的靶物质进行SDS-PAGE电泳，以正常胃黏膜细胞膜提取物作为对照，确定早期胃腺癌原代细胞靶物质的大致分子量。

1.1.2 标志物的分析与鉴定 ①应用常规方法确定分子标志物化学属性(即是糖蛋白、脂蛋白还是糖脂等)：应用高碘酸-硝酸银染色法鉴定电泳凝胶中的糖蛋白；运用琼脂糖凝胶电泳，进行油红O染色和氨基黑10B染色可以鉴定脂蛋白；采用5-甲基间苯二酚显色，加热糖脂可显出紫红色。②运用电泳、层析及HPLC方法纯化5种靶物质，确保达到质谱分析所要求的纯度：利用质谱检测，经NCBInr数据库搜寻进行比对分析，确定所获得的分子标志物的理论分子量、等电点及结构等基本参数。

1.1.3 早期胃腺癌诊断方法的建立 ①对于每一种适配子所捕获的分子标志物进行分析，可得到每一种分子标志物的相关参数，根据理想肿瘤标志物的选择标准选择1种标志物作为诊断的靶点。②以肿瘤标志物建立检测方法：根据标志物的属性，分析其免疫原性，制备单克隆抗体，然后依据此抗体建立3种检测方法：① sp法免疫组化技术检测方法；② 组织裂解免疫发光的检测方法；③ 血清学检测方法建立酶联免疫发光测定法。

1.1.4 检测方法的临床评价 实验方法的评价，以美国临床实验室标准化组织(clinical and laboratory standards institude，CLSI)的相关标准为依据，进行该方法的性能评估实验，主要实验指标包括：敏感性、特异性、阳性似然比、阴性似然比、干扰实验、验前比和验后比。实验的诊断性能评价，参考《临床检验方法学评价》(ISBN：9787117105811 )，以本项目建立的方法为候选方法，以金标准为参考方法，进行方法学比较。评价指标包括灵敏度、特异性、准确度、精确度等。

1.2 主要试剂

胶原酶Ⅳ型、考马斯亮蓝、高碘酸、硝酸银、5-甲基间苯二酚均购置生工生物工程(上海)股份有限公司；Promega链酶亲和素磁珠及磁力架购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司；其它试剂为国产或进口分析纯，0.5 mol/L EDTA(pH8.0),20%(W/V)Glucose,30%丙烯酰胺，5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液，4×SDS-蛋白上样缓冲液。

1.3 胃癌原代细胞ssDNA适配子的筛选及优化

应用0.1%胶原酶Ⅳ型溶液分离得到的早期胃腺癌原代细胞和正常胃黏膜上皮细胞纯度均在90%以上，筛选前经PCR扩增条件优化，确定了其最佳的退火温度为46℃，循环次数为15次。经过12轮筛选后，得到的ssDNA次级文库与早期胃腺癌的结合率达到较高水平。

1.4 统计学方法

应用SPSS 15.0软件进行统计学分析，计数资料比较采用χ2检验，以P<0.05作为有统计学差异的标准。

2 结果

2.1 评价结果

以美国临床实验室标准化组织(CLSI)的相关标准为依据，对实验方法的敏感性、特异性、阳性似然比、阴性似然比、干扰实验、验前比和验后比方面进行评价，结果显示早期胃癌中原代细胞ssDNA适配子的检测敏感性为49.13%，特异性为91.44%，阳性似然比为5.74，阴性似然比为0.56 g，干扰实验51.8%，验前比65.7%，验后比197.2%。

2.2 诊断性能评价结果

根据《临床检验方法学评价》，以本项目建立的方法为候选方法，以金标准为参考方法，从灵敏度、特异性、准确度、精确度方面进行比较，见表1。结果显示，早期胃癌中原代细胞ssDNA适配子的检测结果与金标准相比，在敏感性、特异性、准确度和精确度方面均无明显差异(P>0.05)，无统计学意义。

表1 诊断性能评价结果/%

3 讨论

ssDNA适配子是运用SELEX技术筛选所得到的1种寡核苷酸分子，其具有针对靶物质的特异性和较强的亲和力[5]，而通过PCR扩增可以使寡核苷酸文库中的核酸序列更加丰富，本研究的前期实验结果已证实[7]，应用胶原酶Ⅳ型溶液能成功分离出原代细胞，而且纯度较高，可以作为1种细胞分离的方法应用于后期研究。利用cell-SELEX技术能够针对早期胃腺癌原代细胞筛选出特异性的适配子，并且适配子的结构较完整，二级结构预测中茎环结构可能是适配子与靶细胞结合的结构基础。实验采用荧光素修饰适配子的方法能成功的测定适配子与早期胃腺癌细胞结合的特异性和亲和力。在测试的结果中发现，培养状态下的细胞株与从组织中分离获得的细胞在和适配子结合的时候，两者的荧光强度值具有统计学意义。采用生物素修饰适配子，结合链霉亲和素磁珠分离系统，能够从早期胃腺癌原代细胞表面分离出特异的分子标志物，得知分子标志物的大致分子量，并可以确定细胞膜分子标志物有蛋白质成份。在此基础上我们以美国临床实验室标准化组织(CLSI)的相关标准为依据，对该检测方法的敏感性、特异性、阳性似然比、阴性似然比、干扰实验、验前比和验后比，并与金标准为参考方法，在灵敏度、特异性、准确度、精确度方面进行方法学比较，其结果表明早期胃癌原代细胞ssDNA适配子检测方法的敏感性为49.13%，特异性为91.44%，阳性似然比为5.74，阴性似然比为0.56 g，干扰实验51.8%，验前比65.7%，验后比197.2%，并且与金标准相比，在敏感性、特异性、准确度和精确度方面均无明显差异(P>0.05)，不具有统计学意义。由此，我们认为早期胃癌原代细胞ssDNA适配子的检测，具有较高的灵敏度和较强的特异性，为早期胃癌的临床检测提供了相应的依据，可考虑作为早期胃癌的辅助诊断标准之一。

[1] 潘 源，梁 寒，薛 强，等.国际抗癌联盟和日本胃癌协会胃癌淋巴结分期法与国人胃癌患者预后相关性的比较〔J〕.中华肿瘤杂志,2008,30(5):376-381.

[2] Ferlay J,Shin HR,Bray F,et al.Estimates of worldwide burden of cancer in 2008:GLOBOCAN2008〔J〕.Int J Cancer,2010,127(12):2893-2917.

[3] Sefah K,Shangguan D,Xiong X,et al.Development of DNA aptamers using Cell-SELEX〔J〕.Nat Protoc,2010,5(6):1169-1185.

[4] Zhang Y,Chen Y,Han D,et al.Aptamers selected by cell-SELEX for application in cancer studies〔J〕.Bioanalysis,2010,2(5):907-918.

[5] 曹立亭，许李丽，万 向，等.SELEX 技术中ssDNA 文库PCR扩增条件的优化〔J〕.安徽农业科学，2012，40(6)：3241-3242.

[6] 李真真，韩跃武，刘玲玲,等.SELEX法体外筛选胃癌细胞适配子方法的建立〔J〕.生物技术,2009,19(3):42-46.

[7] 郭 鹏，习 静，张雪燕，等.早期胃腺癌原代细胞适配子的筛选与鉴定〔J〕.中国生物化学与分子生物学报，2013,29(3)：250-256.