4-1BBL在淋巴瘤组织中的表达及其临床意义

姜文国 张树平 董秀红 杨 茗 亢泽春

本研究选取80例淋巴瘤病例，包括非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma，NHL)病例70例，霍奇金病(hodgkin’s disease，HD)10例，利用不同的4-1BBL抗体，在蛋白水平检测了4-1BBL的表达转变为s4-1BBL(soluble 4-1BB ligand)的情况，并结合患者基本情况分析4-1BBL转变与疾病进展和类型的关系。

1 材料与方法

1.1 淋巴瘤病例组织芯片

淋巴瘤组织芯片(NHL803)购自西安艾丽娜生物科技有限公司，含70例非霍奇金淋巴瘤，包括弥漫型B细胞淋巴瘤44例，结节-弥漫型B细胞性淋巴瘤6例，B细胞性黏膜相关性淋巴瘤、滤泡型非霍奇金淋巴瘤各3例，淋巴浆细胞样淋巴瘤2例，Burkitt样淋巴瘤、滤泡中心细胞性非霍奇金淋巴瘤、外套细胞淋巴瘤、淋巴母细胞性T细胞性淋巴瘤、T细胞性淋巴瘤、弥漫型透明T细胞淋巴瘤、Lennert淋巴瘤各1例，间变性大细胞淋巴瘤5例；10例霍奇金病。所有的组织在采集的时候都遵循最高的道德标准，将全部的信息都告知捐献者，并征得他们的同意。

1.2 主要抗体和试剂

检测4-1BBL C端的抗体(sc-11817)购自SANTA CRUZ公司，检测4-1BBL N端的抗体(2305-1)购自Abcam公司；利妥昔单抗(Rituximab，美罗华)购自上海罗氏公司；辣根过氧化物酶标记的抗羊、抗兔和抗人抗体HRP-IgG、浓缩型DAB试剂盒均为北京中杉金桥公司产品。

1.3 免疫组织化学染色分析

将组织芯片于60℃烤箱中烘烤2 h。然后二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化；3% H2O2室温孵育 5～10 min，以消除内源性过氧化物酶的活性；抗原热修复；5%的牛血清白蛋白(BSA)封闭；冲洗后加入利妥昔单抗以及2种4-1BBL抗体孵育过夜；冲洗后分别加入抗人、抗兔和抗羊抗体HRP-IgG；然后采用中杉公司DAB显色试剂盒显色，苏木精复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。在光镜下，阳性细胞显示出棕褐色，Leica显微镜低倍镜下照相保存结果[1]。

1.4 结果判断

相同光照条件、相同放大倍数下，每个组织均单独保留1张全组织的照相结果。免疫组化照片应用Image-Pro Plus 6.0软件中的Pathology批处理程序，分别对4-1BBL N端和C端的抗体对淋巴瘤组织的结合情况进行计算累计光密度值(integrated optical density，IOD)，结合镜下照片确立阳性和阴性标准(IOD值超过500万为阳性)，并结合患者临床资料进行统计分析[2-3]。因为每个组织芯片的面积基本一致，故相关性分析根据具体IOD值按计量资料进行统计分析。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 CD20抗原在淋巴瘤组织中表达情况

排除在实验过程中脱落后不完整的2例组织，余78例有效淋巴瘤，经软件分析，结合免疫组化切片染色情况，设立淋巴瘤组织芯片累计光密度值500万为分界线，超过500万者为阳性。淋巴瘤病例组织中，CD20表达阳性占66.7%。淋巴瘤组织中CD20阳性率与患者年龄及性别无显著相关性；与肿瘤病理类型相关， HD患者CD20抗原的表达水平显著高于NHL患者(表1)。

2.2 4-1BBL在淋巴瘤组织中的表达情况

采用N端抗体检测的是总4-1BBL的表达水平，而C端抗体主要检测膜结合型4-1BBL的表达水平，故总体IOD值N端测定组大于C端测定组。结果表明，4-1BBL表达水平与患者年龄、性别及病理类型等无显著相关性，只是HD患者N端4-1BBL表达水平较NHL患者略高(表2)。另外，对同一组织，采用2种不同抗体分别测定4-1BBL的 IOD值，发现两者IOD值并无显著相关性(P>0.05)。这说明不同的患者4-1BBL转变为s4-1BBL的比率是随机的。

表1 组织芯片分析CD20抗原在淋巴瘤组织中的表达情况

表2 组织芯片分析4-1BBL抗原在淋巴瘤组织中表达情况

3 讨论

CD20表面抗原分子量约为35 kD的，是B淋巴细胞表面特有的分化抗原，它参与了B细胞的增殖、分化、信号转导和钙离子的跨膜传递等多种功能。它表达于90%以上的B淋巴瘤细胞和正常B淋巴细胞，在造血干细胞、原始B淋巴细胞、正常血细胞以及其他组织上不表达。CD20分子具有不易脱落、与抗体结合后不内化、在人体血清中无游离形式存在等特征。因此，作为治疗B 细胞淋巴瘤的理想作用靶点受到了人们的关注。自1997年利妥昔单抗(Rituximab，美罗华)批准上市至今，抗CD20治疗性单克隆抗体发展迅速。现在临床上有多种以CD20抗原为靶点的药物[4]。

本研究中采用利妥昔单抗作为阳性对照测定淋巴瘤患者组织细胞表面CD20抗原的水平，可以在免疫组化染色分析实验中保证操作的规范性。另外，结果中我们发现，CD20在淋巴瘤组织的阳性率与病理类型相关，在HD患者，CD20抗原的表达显著高于NHL患者。当然，国外也有报道，利妥昔单抗在治疗淋巴细胞为主性霍奇金病(lymphocyte predominance Hodgkin’s disease，LPHD)中有一定疗效，本研究中的10例HD，其中有4例是LPHD。很多治疗经验也表明对于CD20表达阳性的HD患者，利妥昔单抗是有效的。最近研究也表明，在HD患者的化疗，尤其是应用抗CD20抗体进行治疗方面，其R-S细胞CD20抗原的表达水平具有指导意义[5]。

s4-1BBL(soluble 4-1BB ligand) 是4-1BBL的可溶性形式，可以检测到几种不同分子量的s4-1BBL。有研究表明： s4-1BBL也是有活性的，在有固定的抗-CD3存在时，它能够传递协同刺激信号给外周T细胞。就目前的研究结果看，产生s4-1BBL至少存在2种机制。第一，体外研究发现，应用基质金属蛋白酶抑制剂(matrix metalloproteinase inhibitor，MMPI )能部分阻断因细胞激活导致的s4-1BBL的释放，明显减少s4-1BBL的水平，从而增加细胞膜表面的4-1BBL，这说明s4-1BBL可能是由基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP )切割产生的[6]。第二，通过选择性剪接，4-1BBL缺失跨膜区直接转变为s4-1BBL，释放出来[7]。2种方式，都造成其逃脱了宿主淋巴细胞的免疫监视，并且减少通过4-1BBL作用到肿瘤细胞的凋亡信号。本研究中发现，采用N端和C端2种抗体测定4-1BBL表达水平，发现两者并无显著相关性。这说明在不同的患者，4-1BBL转变为s4-1BBL的比率是不同的。

另外，在研究我们使用了Image-Pro Plus 6.0软件中的Pathology批处理程序对组织芯片染色结果进行计算量化处理。应用这种计算机辅助的图像分析程序，能很大程度上避免镜下观察染色结果的主观倾向性，结果更加可靠和准确。同时因为组织芯片面积非常一致，也非常适合采用Pathology批处理程序快速计算IOD值，省时省力。通过IOD值的比较也能够获得较手工统计更多的生物学信息[8]。本研究发现在大多数病例， N端测定组IOD值显著大于C端测定组，说明很多s4-1BBL是通过MMP直接切割导致的；另外也有部分病例两者差别不大，或者结果正好相反C端测定组IOD值显著大于N端测定组，这说明也有部分s4-1BBL是直接表达出来转运到细胞外的。综上所述，我们进一步明确了s4-1BBL的产生机制，为淋巴瘤的免疫治疗提供了重要的指导。

[1] 仰丽丽，文 剑.p21和Survivin 在胃癌组织中的表达及临床意义〔J〕.实用癌症杂志，2013，28(5)：483-485.

[2] Xavier LL，Viola GG，Ferraz AC，et al.A simple and fast d-ensitometric method for the analysis of tyrosine hydroxylase immunoreactivity in the substantia nigra pars compacta and in the ventral tegmental area〔J〕.Brain Res Brain Res Protoc，2005，16(1-3)：58-64.

[3] Shi H，Hayes M，Kirana C，et al.TUFM is a potential new prognostic indicator for colorectal carcinoma〔J〕.Pathology，2012，44(6)：506-512.

[4] Robak T.Emerging monoclonal antibodies and related age-nts for the treatment of chronic lymphocytic leukemia 〔J〕.Future Oncol，2013，9 (1)：69-91.

[5] Rassidakis GZ，Medeiros LJ，Viviani S，et al.CD20 expression in Hodgkin and Reed-Sternberg cells of classical Hodgkin's disease：associations with presenting features and clinical outcome〔J〕.J Clin Oncol，2002，20(5)：1278-1287.

[6] Scholl N，Loibl J，Kremser A，et al.The role of soluble and cell-surface expressed 4-1BB ligand in patients with malignant hemopoietic disorders〔J〕.Leuk Lymphoma，2009，50(3)：427-436.

[7] 宋 敏，张树平，徐 珞.CD137L在急性髓细胞白血病中的突变表达及临床意义〔J〕.滨州医学院学报，2012，35(5)：332-334.

[8] Wang CJ，Zhou ZG，Holmqvist A，et al.Survivin expression quantified by Image Pro-Plus compared with visual assessment〔J〕.Appl Immunohistochem Mol Morphol，2009，17(6)：530-535.