四妙勇安汤对H2O2致内皮细胞ECV304损伤的保护作用

李 娜 曲晓波 叶豆丹 李 晶 律广富 林 贺 杨 擎 常志达 张靖卓 李 斌 林 喆

(长春中医药大学研发中心药理实验室，吉林 长春 130117)

四妙勇安激发(SMYA)是治疗热毒性脱疽的经验良方，由金银花、玄参、当归、甘草四味药组成，具有清热解毒、滋阴活血、通络功效。热毒性脱疽是古时候的主要适应证，和现代医学中的多种动脉狭窄或闭塞而导致的趾(指)脱落坏死性疾病相似，包括血栓闭塞性脉管炎、动脉硬化闭塞症、糖尿病性坏疽等疾病〔1～3〕。本研究通过对SMYA对氧化损伤内皮细胞保护作用的研究，为进一步探讨其作用机理奠定了基础。

1 材料与方法

1.1细胞系 人脐静脉内皮细胞株ECV304(长春中医药大学研发中心)，用含10%胎牛血清1640培养基于37℃，5%CO2，饱和湿度培养箱中培养。

1.2药物、试剂与仪器 SMYA醇提物，由长春中医药大学研发中心实验室制备；血管紧张素转化酶(ACE)、内皮素(ET)、内皮型一氧化氮合酶(eNOs)酶联免疫检测试剂盒为美国BG公司产品；流式细胞仪为美国贝克曼库尔特公司。

1.3方法

1.3.1分组 取对数生长期的内皮细胞ECV304随机分成三组：空白组，用正常培养液培养；模型组，H2O2损伤，浓度为1 mmol/L，损伤4 h；SMYA组：先用H2O2损伤4 h后，50%EtOH提取物100 μg/ml培养24 h。

1.3.2四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定细胞活力 消化后的细胞，5×104个/ml，200 μl接种于96孔板，培养24 h完全贴壁，按1.3.1分组，模型组和SMYA组先用H2O2(1 mmol/L，4 h)处理，弃上清，模型组用正常培养基培养，给药组用SMYA醇提物处理24 h，每孔20 μl加入MTT，4 h后甩板，每孔加入150 μl二甲基亚矾(DMSO)使其显色，显色后振动孵育10 min，使结晶溶解完全，酶标仪490 nm测吸光度值(OD值)。

1.3.3SMYA醇提物对氧化损伤ECV304细胞周期的影响 取对数生长期的各组细胞，胰酶消化后收集细胞于离心管中，1 000 r/min离心5 min，弃上清，4℃磷酸盐缓冲液(PBS)清洗2次。将约1 ml，4℃70%乙醇缓缓贴壁加入离心管，固定细胞。上机前，1 500 r/min离心5 min，重新收集细胞，PBS洗2次。加入RNA酶和20 μl溴化碘(PI)，室温避光染色20 min，用300目尼龙网过滤，经流式细胞仪检测。

1.3.4SMYA醇提物对氧化损伤ECV304细胞凋亡率的影响 取对数生长期的各组细胞，胰酶消化后收集细胞于离心管中，1 000 r/min离心5 min，弃上清，4℃PBS清洗两次。先加500 μl Binding Buffer，然后分别将5 μl Annexin V-FITC和PI 10 μl加入，避光孵育10 min，1 h内上机检测。

1.3.5ACE、ET、eNOs含量测定 按1.3.1方法培养细胞后，收集细胞培养液，10 000 r/min，离心10 min，取上清液，按试剂盒要求，检测细胞上清液中ACE、ET、eNOs的含量。

1.4统计学处理 计量资料组间比较行t检验。

2 结 果

2.1SMYA醇提物对H2O2损伤ECV304细胞活力的影响 模型组细胞活力(0.76±0.07)明显低于空白组(1.30±0.19)(P<0.01)，说明模型建立成功；且SMYA组细胞活力(1.34±0.10)均高于模型组(P<0.01)。

2.2SMYA醇提物对H2O2损伤ECV304细胞凋亡的影响 结果显示，空白组细胞凋亡率为9.5%，模型组为23.3%，而SMYA醇提物处理过的损伤后ECV304的凋亡率为13.2%，模型组细胞凋亡率最高，SMYA醇提物干预后细胞凋亡率明显降低。

2.3SMYA醇提物对H2O2损伤ECV304细胞周期的影响 由检测结果分析，模型组与空白组比较，G1期细胞比例增多(P<0.01)，进入S和G2期的细胞百分比减少(P<0.05)，与模型组比较SMYA组，G1期细胞进入S和G2期的细胞百分比增多，G1期细胞百分比显著下降(P<0.05)，S期细胞百分比显著增加(P<0.05)。见表1。

表1 SMYA醇提物对H2O2损伤的ECV304细胞周期的影响±s,n=6，%)

2.4SMYA醇提物对H2O2损伤ECV304细胞中ACE、ET、eNOs影响 模型组H2O2可使ACE和ET的含量明显增高，eNOS活性降低(P<0.05，P<0.01)；与模型组比较，SMYA醇提物可抑制ACE的活性，并可显著性降低ET含量(P<0.05)，升高eNOS活性(P<0.01)。见表2。

表2 SMYA50%醇提物对H2O2氧化损伤ECV304分泌ACE、ET、eNOS的影响±s,n=6)

3 讨 论

SMYA在古代是治疗热毒性脱疽的经验良方，具有清热解毒、滋阴养血、活血化瘀等功效，现代医学多用于治疗周围血管性疾病，前期工作中，建立了血栓闭塞性脉管炎模型大鼠，观察SMYA对其血脂、血液流变学及抗炎的作用，证明了SMYA对血栓闭塞性脉管炎大鼠的治疗作用〔4,5〕。为进一步探讨其机制，从细胞水平进行了研究。

血管内皮细胞(VEC)是覆盖于血管内膜表面的单层扁平或多角形的细胞，形成血管的内壁，与平滑肌细胞和间质细胞等共同构成完整的血管壁〔6,7〕。VEC的功能和血管活性物质，如血管内皮生长因子、内皮素(ET)、一氧化氮(NO)和血管紧张素(ACE)Ⅱ等物质有着密切的联系。VEC受损在多种疾病的发病机制中起到重要作用，例如血栓闭塞性脉管炎。缺氧条件下，可以使内皮细胞功能明显损伤，可探讨血管功能变化与调控机制〔8～10〕。ACE催化血管紧张素(Ang)Ⅰ转化为(Ang)Ⅱ，使缓激肽失活。AngⅡ可导致血压上升，强烈的收缩外周小动脉，促进醛固酮的合成和分泌；重吸收钠离子和水，增加血容量；AngⅡ是最强的升压活性物质。研究表明，SMYA 50%醇提物能够明显抑制过氧化氢损伤ECV 304分泌ACE，阻断了肾素血管紧张素系统的进一步发展。如吴旭等〔11〕认为VEC、ACE在缺血缺氧时表达增多〔12,13〕。

ET和NO是一对相互拮抗的物质，正常生理情况下，两者相互作用，形成稳定的血管内皮调节系统，ET可增加NOS的活性，从而促进NO的生成，而NO又可以反过来拮抗ET的作用。两者之间的这种拮抗作用在维持血管正常收缩与舒张功能和调节局部血流等方面起到重要的作用〔14〕。

G1期又称为合成前期，处于这一期的细胞物质代谢活跃，细胞体积大，为S期DNA复制作物质和能量的准备。S期是DNA合成期，合成组蛋白。G2期是DNA合成后期，是有丝分裂的准备期，DNA合成终止。M期为细胞分裂期。G1期和S期阶段细胞分布的多少，是评价细胞状态和细胞环境的关键。本实验表明，SMYA醇提物可明显促进H2O2损伤ECV304G1期细胞增殖，减少细胞凋亡。本实验通过检测正常内皮细胞、缺氧条件下内皮细胞及SMYA干预缺氧内皮细胞三种细胞的细胞周期，表明SMYA醇提物具有明显降低氧化损伤细胞凋亡率的能力，促进细胞增殖。

本实验建立了内皮细胞缺氧模型，通过检测细胞活性，细胞周期与凋亡，以及内皮细胞分泌ACE、ET和eNOS含量，证明了SMYA醇提物具有明显的保护氧化损伤内皮细胞的作用，为进一步的研究提供了依据。

4 参考文献

1张华一,徐 欣.血栓闭塞性脉管炎的近期治疗进展〔J〕.中华普通外科学文献电子版,2009；3(4):33.

2张翠月,高 征.脱疽的中医内外辨治体会〔J〕.中国实验方剂学杂志,2011；17(9):289-91.

3蔺 爽,李 辉,于 淼,等.四妙勇安汤研究进展〔J〕.世界中西医结合杂志,2012；7(1):84-6.

4李 娜,曲晓波,蔺 爽，等.四妙勇安汤对大鼠血栓闭塞性脉管炎的抗炎作用及其机制〔J〕.吉林大学学报(医学版),2013；39(2):264-7.

5李 娜,曲晓波.四妙勇安汤对血栓闭塞性脉管炎大鼠的保护作用〔J〕.中国实验方剂学杂志,2013；19(8):225.

6Ream E,Richardoson A.Fatigue: a concept analysis〔J〕.Int J Nurs Stud,1996；33(5):519.

7Sangwung P.Proteomic identification of s-Nitrosylated golgi proteins:new insights into endothelial cell regulation by eNOS derived NO〔J〕.Plos One,2012;7(2):7984.

8王 筠,袁 卓,张军平.四妙勇安汤对人脐静脉血管内皮细胞ECV304的增殖作用〔J〕.中华中医药学刊,2007;25(9):1818-20.

9袁 卓,张军平,张仁岗.四妙勇安汤的有效成分对血管内皮细胞增殖的影响〔J〕.上海中医药大学学报, 2008;22(4):69-71.

10刘 真,魏运湘,于慧卿,等.四妙勇安汤对缺氧人脐静脉内皮细胞的影响〔J〕.中国中医药信息杂志,2010；17(5):31-3.

11吴 旭，蒋雄光.蜕皮凿酮对缺血缺氧致血管内皮细胞损伤的影响〔J〕.第三军医大学学报,1998;20(4):358-60.

12韩素霞,李红建，文富强，等.ACE在香烟诱导的仓鼠肺小动脉重构中的表达〔J〕.新疆医科大学学报,2009；32(10):1443-4.

13王景明.血管紧张素转换酶基因多态性与纤溶系统的关系〔J〕.中国实用医药,2011；6(22):7-9.

14李 丹,李玉洁,杨 社，等.血管内皮功能障碍与动脉粥样硬化研究进展〔J〕.中国实验方剂学杂志,2012；18(8):272-6.