异柠檬酸裂解酶肽类抑制剂结构的修饰

刘志远，张爱臣，刘新涛，关晓侠，李玲玲，殷玉和

（1.长春工业大学化学与生命科学学院，长春 130012；2.吉林大学中日联谊医院，长春 130033）

异柠檬酸裂解酶肽类抑制剂结构的修饰

刘志远1，张爱臣2，刘新涛1，关晓侠1，李玲玲1，殷玉和1

（1.长春工业大学化学与生命科学学院，长春 130012；2.吉林大学中日联谊医院，长春 130033）

利用Fmoc固相多肽合成法，按已知异柠檬酸裂解酶抑制剂的直链肽氨基酸序列合成首尾相连的环肽抑制剂.经色谱纯化和质谱鉴定，其相对分子质量的实测值与理论值相符.抑制率实验结果表明，合成的环肽对异柠檬酸裂解酶有明显抑制作用，抑制率大于50%.采用高效液相色谱法分别检测直链肽和环肽在血浆中的半衰期，实验结果表明，环肽在血浆中的半衰期为11min，比直链肽的半衰期延长175%.

异柠檬酸裂解酶；肽类；抑制剂；环肽

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

2－CTC树脂、芴甲氧基羰基（Fmoc）－氨基酸（Fmoc－Pro－OH，Fmocsn（Trt）－OH，Fmoc－Ser（tBu）－OH，Fmocrg（Pbf）－OH）、Fmoc－Glu－Oallyl、苯并三氮唑－N，N，N′，N′－四甲基脲六氟磷酸酯（HBTU）、1－羟基苯并三氮唑（HOBT）、N，N－二异丙基乙胺（DIEA）、三异丙基硅烷（TIS）和三氟乙酸（TFA）均为吉尔生化（上海）公司产品；N－甲基吗啉（NMM）、四（三苯基膦）钯（Pb（pph3）4）、茚三酮、二氯甲烷（DCM）、N，N二甲基甲酰胺（DMF）、六氢哌啶（哌啶，PIP）、无水乙醚、无水甲醇和无水乙醇均为北京化工厂产品.

PET28b－ICL菌种由长春工业大学ICL抑制剂实验组提供，于－80℃冰箱保存.血浆由长春市中心血站提供.

1.2 仪 器

循环水式真空泵（河南予华仪器有限公司）；离心机（湖南湘仪离心机仪器有限公司）；高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；制备型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；恒温培养摇床（上海智城分析仪器制造有限公司）；冻干机（上海东富龙科技有限公司）；超微量分光光度计（美国Thermo Scitific公司，Namo Drop2000型）；电泳仪（上海捷迈科贸有限公司）；分析天平（沈阳龙腾电子有限公司）；质谱仪（德国Bruker公司）.

1.3 方 法

1.3.1 环肽的固相合成 根据直链肽肽序列中含有谷氨酸的特点，以及肽链首尾环化的要求，设计如图1所示的固相合成环肽方法.

图1 固相合成环肽流程Fig.1 Solid phase synthesis of cyclic peptide

1.3.2 环肽的分析、纯化与分子量鉴定 用高效液相色谱分析环肽粗品，高效液相色谱分析条件：C18色谱柱（4.6nm×250nm）；流动相A为V（H2O）∶V（TFA）＝1∶0.05，有机相B为V（乙腈）∶V（H2O）∶V（TFA）＝90∶10∶0.05；进样量为10μL，流速为1mL／min.

用制备型高效液相色谱仪纯化环肽纯品，制备条件：C18色谱柱（20nm×250nm）；流动相A为V（H2O）∶V（TFA）＝1∶0.25；有机相B为V（乙腈）∶V（H2O）∶V（TFA）＝60∶40∶0.25；流速为10mL／min.将所得肽纯品真空冷冻干燥后于－20℃冰箱保存备用.

利用质谱仪测量高效液相色谱仪主峰产物的相对分子质量，检测模式为反射模式.

1.3.3 ICL的提取 对菌种PET28b－ICL进行增菌培养，当OD值为0.6～0.8时，加入异丙基－β－D－硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）对ICL进行诱导表达.在诱导表达后的菌体中加入菌体裂解液（50mmol Tris－HCl，pH＝8.0），吹匀菌体，于冰上搅拌30min后冰浴下超声破菌至透明，静置30min以上，以10 000r／min离心30min后，取上清液，用镍离子螯合型琼脂糖凝胶亲和层析柱进行纯化.纯化后的ICL蛋白经十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）进行鉴定分析.

1.3.4 合成环肽对ICL抑制作用的检测 异柠檬酸在ICL的催化下生成琥珀酸和乙醛酸.乙醛酸可通过乳酸脱氢酶（LDH）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）还原为甘醇酸酯，其中NADH在340nm处的光吸收值最大.通过分析实时监测NADH在340nm处光吸收值的变化可检测ICL的酶活性.

在总体积为600μL反应体系中加入一定量的3－（N－吗啉基）丙磺酸（MOPS）缓冲液（50mmol／L MOPS，5mmol／L MgCl2，5mmol／L L－cysteine，1mmol／L EDTA，pH＝6.8）、纯化蛋白ICL 50mL、LDH 10μL和NADH 40μL（2mmol），在37℃恒温水浴中作用20min，加入100μL异柠檬酸（20mmol／L），用超微量分光光度计实时监测340nm处的光吸收值.同时设不加酶和不加底物（异柠檬酸）的对照组.

向上述反应体系中加入50μL合成的环肽，用超微量分光光度计实时监测340nm处的光吸收值.抑制率计算公式为

1.3.5 合成环肽在血浆中的稳定性检测 将180μL乙腈沉淀后的血浆于37℃孵育5min.取20μL浓度为10－2mol／L合成的环肽置于正在孵育的血浆中，震荡均匀后迅速取出20μL混合液置于离心管中，将其记为0min样品，然后分别在5，10，15，20，25，30min各取出20μL样品.

酶解过程的终止：在取出的样品中加入90μL乙腈振荡混匀后，将样品置于冰上5min，再用90μL（体积分数为0.5%）的冰醋酸稀释终止酶解过程.以13 000r／min离心15min，取上清液，于－80℃冰存，以备高效液相色谱仪分析［14］.

高效液相色谱条件：C18色谱柱（4.6nm×250nm）；流动相A为V（H2O）∶V（TFA）＝1∶0.05，有机相B为V（乙腈）∶V（H2O）∶V（TFA）＝90∶10∶0.05，洗脱梯度为5%～95%，进样量为10μL，流速为1mL／min.

由峰面积计算可得肽的质量浓度ρ，将肽质量浓度的对数（lgρ）和时间（t）进行线性回归，由回归方程可得半衰期［5］为

2 结果与讨论

2.1 环肽粗品的分析与纯化

肽与树脂分离后，在真空中干燥可得白色环肽粗品176mg，经制备型高效液相色谱法（HPLC）纯化，收集目标产物峰真空冷冻干燥可得质量分数为99.3%的肽纯品25mg.肽纯品HPLC的检测结果如图2所示，分子结构如图3所示.纯化后环肽的分子量为777.83，与目标环肽相对分子质量一致.

图2 纯化后环肽HPLC的检测结果Fig.2 HPLC graph of the high purity cyclic peptide

图3 目标环肽分子结构Fig.3 Molecular structure of the target cyclic peptide

2.2 ICL浓度检测

将经镍离子螯合型琼脂糖凝胶亲和层析纯化后的酶蛋白分装在7支EP管中，对7支EP管中的酶蛋白进行SDS－PAGE检测，结果如图4所示.由图4可见，5号EP管中蛋白的质量分数最高，将其于－80℃冰存，以备酶活性检测.

2.3 ICL的酶活性实验

分别将直链肽与合成的环肽（5mg／mL）置于检测酶活性的反应体系中，总反应时间为600s，实时监测NADH在340nm处的吸光度值.直链肽与环肽对ICL抑制作用的检测结果如图5所示.由图5可见：在直链肽与ICL的反应体系中，反应时间为330s；在环肽与ICL的反应体系中，反应时间为410s；抑制率分别为55.5%和64.7%.

图4 ICL的SDS－PAGE检测结果Fig.4 SDS－PAGE graph of ICL

图5 环肽和直链肽对ICL抑制作用的检测结果Fig.5 Inhibition effects of the cyclic peptide and the linear peptide on ICL

2.4 环肽在血浆中的稳定性实验

在血浆中分别加入质量浓度均为2mg／mL的直链肽和环肽，直链肽和环肽在血浆中的半衰期如图6所示.由图6可见，直链肽和环肽的半衰期分别为4min和11min，即环化后的肽比直链肽的半衰期延长175%.

图6 直链肽（A）和环肽（B）在血浆中的半衰期Fig.6 Half－life of the linear peptide（A）and the cyclic peptide（B）

综上可见，本文采用Fmoc固相合成法合成了首尾相连环肽［cyclo（Asn－Pro－Pro－Glurg－Ser－Pro）］，其分子量为777.83，质量分数为99.3%，对ICL的抑制率为64.7%，半衰期为11min.

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（责任编辑：单 凝）

Modification of Isocitrate Lyase Peptide Inhibitor

LIU Zhiyuan1，ZHANG Aichen2，LIU Xintao1，GUAN Xiaoxia1，LI Lingling1，YIN Yuhe1
（1.School of Chemistry and Life Science，Changchun University of Technology，Changhun130012，China；2.China－Japan Union Hospital，Jilin University，Changhun130033，China）

Fmoc solid－phase peptide synthesis was used to synthesize cyclic peptide in light of the known isocitrate lyase linear peptide sequence according to the end to end way.Mass spectrometry demonstrates that the measured value of relative molecular mass is consistent with the theoretical value.Inhibition test confirms that the cyclic peptide shows significant inhibition to the ICL activity（the inhibition rate was more than 50%）.At the same time，half－life of linear peptide and that of cyclic peptide in plasma were measured by HPLC.Results indicate that half－life of cyclic peptide in plasma amounts to 11min，which is increased by 175%compared with that of linear peptide.

isocitrate lyase；peptide；inhibitor；cyclic peptide

Q78

A

1671－5489（2014）04－0847－05

结核病（tuberculosis）是由结核分枝杆菌（Mycobacterium）引起的慢性传染病.结核杆菌被巨噬细胞吞噬后，在巨噬细胞内转为持留状态，通过乙醛酸循环途径获取能量，维持其在宿主体内的长期持留存在［1］.异柠檬酸裂解酶（isocitrate lyase，ICL）是乙醛酸循环中的关键限速酶之一，对结核杆菌维持其持留状态起决定性作用［2］.氨基酸序列为NPPERSP的直链肽对异柠檬酸裂解酶有明显抑制作用［3］.吴从梅等［4］利用噬菌体肽库筛选技术与Fmoc固相合成法合成了对ICL具有抑制作用的直链肽；迟强等［5］将胸腺五肽合成胸腺五肽乙酯，使其在血浆中的半衰期由1.3min延长至2min.由于直链肽药物进入体内后可被酶迅速代谢降解，因此其半衰期较短.通过化学修饰可延长多肽类药物的半衰期［6］.

研究表明，将直链肽合成为环肽可提高多肽的活性和稳定性［7］.在环肽合成中，固相合成法与液相合成法相比，能有效避免发生二聚和多聚等副反应［8－10］.本文将直链肽NPPERSP进行首尾相连环化，获得了生物活性较高的环肽抑制剂［11－13］，并对合成的环肽分别进行异柠檬酸裂解酶抑制率检测和血浆中稳定性的检测.

10.13413／j.cnki.jdxblxb.2014.04.42

2013－09－29.

刘志远（1987—），男，汉族，硕士研究生，从事生物制药的研究，E－mail：124273183＠qq.com.通信作者：殷玉和（1972—），男，汉族，博士，讲师，从事生物制药的研究，E－mail：yyh72＠sina.com.

吉林省教育厅科技发展计划项目（批准号：2009110）.