miR-92对前列腺癌细胞增殖及凋亡的影响

张 华 樊 霞 张明华

(武警后勤学院附属医院检验科,天津 300162)

前列腺癌是发生于老年男性常见的泌尿系统肿瘤之一，高达95%的病例发病年龄在60～80岁。它的早期症状不明显，病因研究不清楚，病人的预后根据发病的症状而不同。近年的研究发现前列腺癌的发生和发展与微小RNA(miRNA)关系密切〔1〕。miRNA是一类长度为22个核苷酸，内源性的非编码单链小RNA分子，通过与靶基因3'UTR上的结合位点互补结合，导致靶基因mRNA的降解或者翻译抑制，在转录后水平调控着基因表达〔2〕。研究发现miRNA调控着60%编码蛋白的基因表达〔3〕，广泛参与各种生物学过程〔4〕。本研究拟探讨miR-92对前列腺癌细胞增殖和凋亡的影响。

1 材料和方法

1.1材料 人前列腺癌细胞系PC-3和DU-145由本实验室保存，32个前列腺癌和26个良性前列腺增生组织由武警后勤学院附属医院泌尿外科提供，均经过病理学鉴定。DMEM培养基和Opti-MEM无血清培养基均由Gibco公司提供，10%胎牛血清由Sigma公司提供，转染用的脂质体LipofectamineTM2000由美国的Invitrogen公司提供，miR-92的反义寡核苷酸和对照核苷酸由上海吉玛公司提供，实时定量PCR的试剂由美国的Applied Biosystems提供，细胞增殖检测试剂盒由 广州市锐博生物科技有限公司提供，荧光素探针(Annexin V-FITC/EGFP)凋亡检测试剂盒由美国罗氏公司提供。

1.2方法

1.2.1总RNA的提取 利用QIAGEN公司的RNA提取试剂盒进行RNA提取，然后检测OD260和OD280的吸光度值，进行RNA质量和浓度的测定。

1.2.2逆转录反应合成cDNA 取0.5 μg RNA进行逆转录反应，加入特异的miR-92的逆转录引物和焦碳酸二乙酯(DEPC)水，总体积13 μl，25℃反应5 min，冰置2 min后，加入5×逆转录酶缓冲液4 μl，逆转录酶和RNA酶抑制剂1 μl，总体积20 μl，42℃反应1 h，70℃反应10 min，得到cDNA产物，同时以U6作为内源性对照。

1.2.3实时定量PCR检测miR-92的水平 取cDNA模板1 μl，miR-92的特异性前向引物1 μl，通用的反向引物1 μl，2×SYBR Green Master Mix 10 μl，添加无菌蒸馏水至20 μl总体积，按照以下反应程序进行：95℃ 5 min，之后是40个循环(95℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 30 s)，同时以U6作为对照。

1.2.4噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞的活性 细胞在转染前接种到48孔培养板，无血清培养基培养。待第2天细胞密度达到80%左右时，细胞转染miR-92的反义寡核苷酸和对照。转染后将细胞接种到96孔板继续培养，分别在转染后48、72、96 h加入MTT继续培养4 h，然后吸掉上清加入DMSO溶解10 min，最后用酶标仪读取在570 nm处吸光值(A570 nm)。

1.2.5EdU细胞增殖法检测细胞的增殖情况 细胞转染如上述过程，细胞在转染后48 h加入EdU，继续培养2 h后进行细胞的固定和染色，按照EdU细胞增殖试剂盒的说明进行，最后用流式细胞仪分析细胞的增殖情况，统计EdU阳性的细胞数。

1.2.6Annexin-V/PI双重染色法检测细胞的凋亡情况 48 h后收集转染的细胞，按照Annexin-V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒的说明进行，收集的细胞中加入100 μl 1 × Binding 缓冲液重悬，加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI 染料,轻轻混匀，避光、室温反应10 min。加入400 μl 1× Binding缓冲液，轻轻混匀。样品在1 h内用流式细胞仪检测。根据染色结果统计发生早期凋亡的细胞数。

2 结 果

2.1组织中miR-92的表达水平 与良性前列腺增生组织相比，miR-92在前列腺癌中的表达水平显著升高(P<0.05)。见图1。

2.2转染anti-miR-92后细胞中miR-92表达水平 与转染对照寡核苷酸组(设为1)相比，转染anti-miR-92的细胞中miR-92的表达水平(PC-3细胞：0.17±0.021，DU-145细胞：0.19±0.023)降低(P<0.01)。

2.3MTT比色法检测anti-miR-92对细胞活性的影响 与对照组相比，anti-miR-92能够显著抑制两种细胞的活性，且组间差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

图1 前列腺癌和良性前列腺增生组织中miR-92表达

表1 anti-miR-92对PC-3、DU-145细胞活性的影响

2.4EdU细胞增殖法检测anti-miR-92对细胞增殖的影响 与对照组细胞相比，anti-miR-92导致EdU阳性的细胞数减少，细胞增殖受抑制，在两种细胞中产生类似的结果，差异均有统计学意义(均P<0.05)。见表2。

表2 anti-miR-92对PC-3和DU-145细胞增殖的影响

2.5Annexin-V/PI双重染色法检测anti-miR-92对细胞凋亡的影响 与对照比相比，转染anti-miR-92后细胞的凋亡增加(P<0.05)。见表3。

表3 anti-miR-92对PC-3和DU-145细胞凋亡的影响

3 讨 论

miRNA在肿瘤的发生过程中发挥着基因调控因子的作用，它的异常表达与肿瘤的发生密不可分〔5〕。为阐明miRNA在肿瘤中发挥的作用以及分子机制，首先需要得到差异性表达的miRNAs。一般通过miRNA表达谱分析和芯片技术初步得到在肿瘤中差异性表达的miRNA。De Preter等〔6〕在神经母细胞瘤病人中进行miRNA表达谱分析，结果发现miR-92在前列腺癌中高表达，并且与不良的预后关系密切。此外，对神经母细胞瘤进行药物治疗后，导致神经母细胞瘤中具有癌基因活性的miR-92表达降低〔7〕。这些研究表明miR-92在肿瘤细胞的发生发展中发挥着重要的作用，但是关于它在前列腺癌中的具体作用至今研究甚少，在本研究中，证实了miR-92在前列腺癌中表达升高，与以前的研究结果相似。

细胞的增殖和凋亡是影响肿瘤生长的重要因素，本研究结果表明miR-92可能发挥着癌基因的活性。miR-92是miR-17-92族的成员，这一家族在细胞的增殖中发挥着重要的作用。在骨髓瘤细胞中发现miR-92促进癌细胞的增殖〔8〕。在结肠癌中，miR-92也扮演着癌基因的角色〔9〕。

miRNA是通过作用于它的靶基因而发挥作用，利用生物信息学预测了miR-92的候选靶基因是PTEN和BCL2L11。先前的研究证实在肝癌中PTEN与miR-92的表达呈负相关〔10〕。在胶质瘤中BCL2L11受miR-92负调控，是miR-92的靶基因〔11〕。而PTEN〔12〕和BCL2L11分别在肝癌和胶质瘤中扮演着抑癌基因的角色，抑制肿瘤细胞的生长。这些作用与miR-92的作用相关，因此，我们推测在前列腺癌中PTEN和BCL2L11是miR-92的直接靶基因，介导miR-92作用的发挥，但是还需要进一步的验证。同时，这些研究也说明了一种miRNA可能同时调控靶基因，参与一系列生物学过程的发生。而miRNA与多种靶基因之间的靶定关系可能和miRNA与靶基因3'UTR上的结合位点的不完全互补有关。

总之，本文中发现miR-92在前列腺癌中高表达并且促进了前列腺癌细胞的生长,抑制了前列腺癌细胞的凋亡。 通过预测PTEN和BCL2L11为miR-92的潜在靶基因。这一结果为寻找前列腺癌的致病提供了新的分子机制，并且为探索治疗前列腺癌新的分子标志物提供了新策略。

4 参考文献

1Zhang H,Qi M,Li S,etal. MicroRNA-9 targets matrix metalloproteinase 14 to inhibit invasion,metastasis,and angiogenesis of neuroblastoma cells〔J〕.Mol Cancer Ther,2012；11(7): 1454-66.

2Bartel DP. MicroRNAs: genomics VT,biogenesis,mechanism,and function〔J〕.Cell,2004;116(2): 281-97.

3Zhang LY,Liu M,Li X,etal. MiR-490-3p modulates cell growth and epithelial to mesenchymal transition of hepatocellular carcinoma cells by targeting endoplasmic reticulum-Golgi intermediate compartment protein 3(ERGIC3)〔J〕.J Biol Chem,2012;288(6):4035-47.

4Ambros V. The functions of animal microRNAs〔J〕.Nature,2004;431(7006): 350-5.

5Calin GA,Sevignani C,Dumitru CD,etal. Human microRNA genes are frequently located at fragile sites and genomic regions involved in cancers〔J〕. Proc Nati Acad of Sci USA,2004;101(9): 2999-3004.

6De Preter K,Mestdagh P,Vermeulen J,etal. miRNA expression profiling enables risk stratification in archived and fresh neuroblastoma tumor samples〔J〕. Clin Cancer Res,2011;17(24):7684-92.

7Chakrabarti M,Khandkar M,Banik NL,etal. Alterations in expression of specific microRNAs by combination of 4-HPR and EGCG inhibited growth of human malignant neuroblastoma cells〔J〕. Brain Res,2012;1454:1-13.

8Manni I,Artuso S,Careccia S,etal. The microRNA miR-92 increases proliferation of myeloid cells and by targeting p63 modulates the abundance of its isoforms〔J〕. FASEB J,2009;23(11): 3957-66.

9Tsuchida A,Ohno S,Wu W,etal. miR-92 is a key oncogenic component of the miR-17-92 cluster in colon cancer〔J〕. Cancer Sci,2011;102(12): 2264-71.

10Zhao B,Zhu Y,Cui K,etal. Expression and significance of PTEN and miR-92 in hepatocellular carcinoma〔J〕. Mol Med Rep，2013；7(5):1413-6.

11Niu H,Wang K,Zhang A,etal. miR-92a is a critical regulator of the apoptosis pathway in glioblastoma with inverse expression of BCL2L11〔J〕. Oncol Rep,2012;28(5):1771-7.

12Meng F,Henson R,Wehbe-Janek H,etal. MicroRNA-21 regulates expression of the PTEN tumor suppressor gene in human hepatocellular cancer〔J〕.Gastroenterology,2007;133(2): 647-58.