全麻药丙泊酚通过上调MT-3减轻沙鼠全脑缺血再灌注损伤

韩 彬 赵俊莺 向富森 舒 雅

(西安医学院第一附属医院麻醉科，陕西 西安 710077)

缺血性脑血管病(ICVD)在脑血管疾病中最为严重，大约占80%〔1〕，严重威胁着人类的健康和寿命。丙泊酚(Propofol)是临床上常用的静脉麻醉药，其半衰期短，麻醉作用较为明显，有研究证明，Propofol对脑出血以及脑缺血都有较好的脑保护作用。金属硫蛋白(MT)富含半胱氨酸的低分子量蛋白质，广泛分布于生物体。MT家族有4种异构体，分别为MT-1、MT-2、MT-3和MT-4。MT-3是被广泛研究的新基因，有肝脏合成、抗衰老等多种重要生物学功能〔2〕。Propofol可以通过上调MT-3保护海马神经元细胞。本研究拟通过建立沙土鼠脑缺血再灌注损伤模型(CIRM)，探讨Propofol通过上调MT-3基因mRNA的表达量减轻ICVD损伤。

1 材料与方法

1.1对象 健康雄性清洁级蒙古沙土鼠30只，体重〔55～75平均(65±5)〕g，浙江省实验动物中心提供。

1.2实验药品 Propofol(意大利 AstraZeneca 公司产品，规格为 200 mg：20 ml)，大鼠组胺试剂盒 (RapidBio Lab)；MT-3抗体(Sigma公司)、HRP标记的兔抗鼠二抗(Chemicon公司)。

1.3造模 沙土鼠均在术前 24 h禁食，自由饮水。腹腔注射3%戊巴比妥钠 45 mg/kg麻醉。麻醉后， 分离双侧颈总动脉，然后用无损伤微动脉夹，同时夹断双侧颈总动脉血，检查远端血流情况以确保完全阻断血流造成脑缺血模型。脑缺血10 min后，松开动脉夹恢复脑血流2 h即为CIRM。

1.4分组 将沙土鼠用随机数列表分为假手术组、模型组和Propofol组。假手术组仅游离双侧颈总动脉但不阻断脑血流；模型组及Propofol组建立CIRM,Propofol组在再灌注即刻，经舌静脉泵注射Propofol 10 mg·kg-1·h-1，模型组用等量生理盐水代替，维持2 h。实验维持期间鼓膜温度为36.5℃～37.5℃；再灌注2 h处死大鼠。

1.5神经功能评分 沙鼠在再灌注2 h后开始表现一定程度的神经功能损伤行为，给予Propofol治疗后，其神经功能有一定程度的恢复，评分细则和评分见表1。

表1 Garcia JH评分标准

1.6RT-PCR检测转染后各组细胞内MT-3基因的表达 RT-PCR方法:扩增MT-3 基因片段大小为217 bp,上游引物为:5'-GACCTGCCCCTGCCCTTCTGGTGG-3'，下游引物为5'-GCTCCACACGGAGGGGTGCCTTCT-3'。PCR 产物在2%琼脂糖凝胶上电泳分析。应用荧光化学发光凝胶成像系统进行结果分析。

1.7Western 印迹法检测 取大鼠海马组织标本称重,每克组织加入10 ml细胞裂解缓冲液,冰上机械匀浆,4℃以10 000 r/min离心10 min,离心半径为10 cm,取上清液,用Bradford法测定蛋白含量,取蛋白样品加等体积的2×电泳样品缓冲液加热变性,以20 μg蛋白/泳道上样,经10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳后,转移至硝酸纤维膜。丽春红S染色确定转膜,并标记蛋白质标准参照物位置,用5%脱脂奶粉封闭。依次加入MT-3抗体及二抗,二氨基联苯胺(DAB)显色剂显色,用GIS系统定量扫描灰度值。

1.8脑组织超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)测定 将各组脑组织匀浆用0.9%钠溶液按质量制备 10%的脑组织匀浆(体积比为1∶9)，匀浆中取样品采用722型光栅分光光度计分别测定脑组织中 SOD、MDA、NO值。

2 结 果

2.1神经功能评分 假手术组的Garcia JH评分为17.1±0.25，模型组为8.51±0.52，Propofol组为12.82±0.68；假手术组与模型组比较有统计学意义(P<0.01)； 模型组与Propofol组比较统计学意义(P<0.01)。

2.2MT-3 mRNA的相对表达 RT-PCR半定量结果显示：Propofol组的MT-3基因mRNA的表达水平(208.6±14.83)与假手术组(45.7±8.52)、模型组(23.5±4.57)对比差异显著(P<0.05)。见图1。

图1 MT-3 mRNA的相对表达

2.3海马组织MT-3的蛋白相对表达 Western结果显示，Propofol组的MT-3蛋白表达量(84.5±15.4)明显高于假手术组(38.6±8.21)与模型组(21.7±3.69)(P<0.01)。见图2。

图2 MT-3的蛋白相对表达

2.4Propofol对沙鼠脑组织SOD、MDA、NO的影响 Propofol组大鼠脑组织 SOD、MDA和NO分别为88.1±8.9，0.91±0.27和0.51±0.18；假手术组为45.6±7.1，2.10±0.62和3.56±0.67；模型组为64.9±9.5，1.67±0.41和1.82±0.51。假手术组与模型组SOD比较有统计学意义(P<0.000 01)； 模型组与Propofol组比较有统计学意义(P<0.000 01)。假手术组与模型组MDA比较有统计学意义(P<0.000 01)；模型组与Propofol组比较有统计学意义(P<0.000 01)。假手术组与模型组NO比较有统计学意义(P<0.000 01)； 模型组与Propofol组比较有统计学意义(P<0.000 01)。

3 讨 论

脑缺血再灌注损伤重要原因是基损伤〔3〕。在正常情况下，SOD可以根据生理性需要及时消除或生成，是由于机体的代谢损伤而产生。在大脑缺血情况下，自由基清除酶活性降低，自由基增多〔4〕。生成大量ROS后，导致蛋白质降解、核酸断裂、最终死亡。脑缺血再灌注损伤时，MDA、NO 参与了损伤过程，SOD 则阻断此过程，SOD、MDA、NO等自由基损伤的指标与脑缺血再灌注损伤密切相关〔5〕。

Propofol具有较强的抗氧化性,具有显著的大脑保护作用。有研究发现，Propofol具有与巴比妥类药物相似的保护作用，包括降低脑代谢率和神经细胞能量消耗，减轻脑水肿。此外Propofol还能减少兴奋性氨基酸的产生，减少钙内流等〔6〕。实验〔7〕证明Propofol能抑制CIRM神经元凋亡，阻止延迟性神经元死亡，可以通过上调MT-3保护海马神经元细胞。

本研究结果表明Propofo通过上调MT-3量，增加SOD活力，降低MDA和NO从而降低自由基损害，减轻 NO 的毒性作用而减轻脑缺血损伤。Propofol可以通过上调MT-3保护大鼠ICVD。

4 参考文献

1Kumar R,Azam S,Sullivan JM,etal. Brain ischemia and reperfusion activates the eukaryotic initiation factor-alpha kinase,PERK 〔J〕. J Neurochem,2001;77(5):1418-21.

2He J,Huang C,Jiang J,etal. Propofol exerts hippocampal neuron protective effects via up-regulation of metallothionein-3〔J〕. Neurol Sci,2013;34(2):165-71.

3Wilson JX,Gelb AW.Free radicals,antioxidants,and neurologic injury:possible relationship to cerebral protection by anesthetics〔J〕. J Neurosurg Anesthesiol,2002;14:66-79.

4Gehrau RC,Mas VR,Dumur CI,etal.Regulation of molecular pathways in ischemia-reperfusion injury after liver transplantation〔J〕. Transplantation,2013;27.

5张 曙,谢海辉,唐兴宁.丙泊酚引起长时间的逆行性遗忘2例报告〔J〕.麻醉与监护论坛,2009;16(1): 70-1.

6李 玲，马瑜红，王素青.乌附经方预处理对大鼠缺血再灌注心肌细胞凋亡的影响〔J〕.中国中西医结合杂志，2013;33(6):789-94.

7Bonney S,Kominsky D,Brodsky K,etal. Cardiac per-functions as novel link between fatty acid metabolism and myocardial inflammation during ischemia and reperfusion Injury of the heart〔J〕. PLoS One,2013;8(8):e71493.