PBEF在体外循环术后肺血管内皮通透性中的机制研究

南昌大学第二附属医院心胸外科,江西 南昌 330006

PBEF在体外循环术后肺血管内皮通透性中的机制研究

杨威董啸周建良龚艺徐建军

南昌大学第二附属医院心胸外科,江西 南昌 330006

目的探讨PBEF在体外循环术后肺血管内皮通透性增加中的机制，为提出更好的体外循环期间肺保护措施提供依据。方法建立动物模型并进行分组，A组仅行病毒转染；B组仅行30min深低温停循环；C组行病毒转染后，再行30min深低温停循环。应用Western blot检测各组大鼠肺组织。结果C组的PBEF、磷酸化P38MAPK、磷酸化ERK、磷酸化MLC、磷酸化VE-cadherin、磷酸化FAK表达明显高于A、B组和对照组。结论PBEF通过P38MAPK、ERK等途径改变内皮细胞和平滑肌细胞中MLC的磷酸化状态，VE-cadherin和FAK也参与了肺血管内皮通透性增加的过程。

前B细胞克隆增强因子；体外循环；肺血管内皮；通透性

体外循环(cardiopulmonary bypass, CPB)技术是心脏外科手术的必备条件,但其带来的术后肺损伤等并发症一直威胁着行心脏手术的患者，重者发展为呼吸窘迫综合症，甚至死亡，严重威胁到患者的生存和预后。前B细胞克隆增强因子(pre-B-cell colony enhancing factor, PBEF)作为一种具有生长因子、细胞因子和烟酰胺磷酸核糖基转移酶作用的分子，认为PBEF在急性肺损伤中起到非常重要的作用。并参与调控炎症、氧化应激、细胞凋亡、内皮血管形成、心脏保护效应和免疫应答等多种作用。但具体机制仍不清楚，因此通过建立大鼠模型分析PBEF的作用机制，结果现报告如下。

1 资料和方法

1.1 一般资料 选择体重在25～30g之间的成熟雄性昆明种小鼠进行动物实验(南昌大学心血管病研究所提供)，按不同处理方法分4组，每组10只，所有小鼠均在室温(24±2)℃，湿度(55±5)%环境中饲养，自由饮水、摄食，如在实验过程中动物死亡，选取新小鼠进行补充。对照组动物在麻醉后建立体外循环，不行体外循环转流；A组动物行慢病毒AD-PBEFshRNA转染，在麻醉后建立体外循环，不行体外循环转流；B组动物在建立体外循环后进行30min深低温停循环；C组动物行同种病毒转染后，再进行30min深低温停循环。Western blot和免疫组化试剂盒购自美国Sigma公司。

1.2 方法 大鼠处死后取右肺前叶用于肺组织湿干重比的测定，右肺中后叶留待Western blot、ELISA和免疫组化检测。按试剂盒说明分别进行Western blot和ELISA检测，Western blot检测磷酸化P38MAPK、磷酸化ERK、磷酸化MLC、磷酸化VE-cadherin、磷酸化FAK表达。免疫组化检测PBEF，镜检以出现棕黄色颗粒为阳性反应[1]。

2 结果

2.1 Western blot检测结果 各组Western blot检测结果见表1，C组磷酸化P38MAPK、磷酸化ERK、磷酸化MLC、磷酸化VE-cadherin、磷酸化FAK表达与A组、B组和对照组的差异显著，具有统计学意义，P<0.05。见表1。

2.2 免疫组化检测结果 A、B、C组在肺泡上皮细胞、肺血管内皮细胞胞核及气管粘膜上皮细胞均有广泛的棕黄色颗粒，PBEF高表达。C组PBEF的表达明显高于A、B组和对照组，表达差异显著，具有统计学意义，(P<0.05)；C组的PBEF表达与对照组的差异显著，具有统计学意义，P<0.05。见表2。

表1 各组Western blot检测结果

注：与对照组比较，*P<0.05；与C组比较，#P<0.05。

表2 各组免疫组化检测PBEF结果

注：与对照组比较，*P<0.05；与C组比较，#P<0.05。

3 讨论

CPB技术随着设备和技术的不断进步，CPB带来的并发症已逐渐减少，但CPB术后肺缺血再灌注损伤仍是CPB术后死亡的主要原因之一[2-3]。虽然多年的研究从多方面解释了CPB术后肺损伤的产生原因，因此通过针对产生肺损伤的分子机制的靶向研究，以明确靶向分子在CPB术后中的作用，为开发新的治疗策略和新的防治药物提供一定的研究经验。

PBEF作为B细胞早期分化的一种生长因子，在炎症细胞因子促进延长中性粒细胞生存期的过程中，会明显增多细胞内PBEF的表达，在急性肺损伤动物模型中研究显示PBEF的血清、肺组织中的表达明显增加[4]。本研究就是通过RNAi技术抑制组织PBEF的表达，通过降低PBEF的表达以减少Ca2+的流动，改善内皮细胞屏障功能，抵消炎症细胞因子对中性粒细胞的抗凋亡作用[5-8]。C-1535T作为PBEF基因启动子区域，发生T变异会改变PBEF基因启动子与转录因子的结合能力，降低PBEF的表达，减少炎症反应时间，进而减少肺功能的损伤。本研究各组免疫组化检测PBEF结果显示，A、B、C组PBEF高表达，对照组PBEF低表达。PBEF过表达会延长炎症反应时间，通过丝裂原活化蛋白激酶(mitogen一aetivatedproteinkinas, MAPK)途径诱导炎症因子的大量释放，加重肺损伤。MAPK主要包括P38MAPK和ERK，磷酸化P38MAPK和ERK能够通过多种胞内信号途径改变会影响细胞收缩功能，降低PBEF蛋白表达进而改善凝血酶刺激造成的内皮细胞屏障功能障碍[9]。本研究显示C组磷酸化P38MAPK、磷酸化ERK、磷酸化MLC、磷酸化VE-cadherin、磷酸化FAK表达明显高于A组、B组和对照组，由此可知通过抑制PBEF的表达，可间接影响MAPK途径多种酶表达表达。在血管内皮细胞内特异性表达，在内皮细胞间连接及血管内皮的通透性调节上具有重要作用。VE-cadherin通过调节上皮细胞激酶激活PI3K，而FAK能够激活MAPK信号转导分子，参与细胞信号转导过程。从研究结果来看VE-cadherin和FAK可能参与了肺血管内皮通透性增加的过程[10]。

综上所述，PBEF通过P38MAPK、ERK等途径改变内皮细胞和平滑肌细胞中MLC的磷酸化状态，VE-cadherin和FAK也参与了肺血管内皮通透性增加的过程，肺组织病理损害严重时VEGF、MMP2、MMP9呈现高表达。

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ResearchofthemechanismofPBEFinpulmonaryvascularendothelialpermeabilityincreasingafterCPB

YANG Wei，DONG Xiao，ZHOU Jian-linng，GONG Yi，XU Jian-jun

Surgery Department of the Second Affiliated Hospital of Nanchang University,Nandang 330006,China

ObjectiveTo investigate the mechanism of PBEF in pulmonary vascular endothelial permeability increasing after CPB, in order to provide the basis for a better lung protective measures during cardiopulmonary bypass.MethodAnimal models were established, group A: the rats were transfected with the lentiviral AD-PBEFshRNA; group B: the rats were took 30min deep hypothermic circulatory arrest; group C: the rats were took 30min deep hypothermic circulatory arrest, then transfected with the lentiviral AD-PBEFshRNA. Lung tissue was detected with Western blot.ResultsPBEF, phosphorylation of P38MAPK, ERK, MLC, VE-cadherin, FAK in group C had significant difference with group A, B and the control group.ConclusionPBEF can change the phosphorylation state of the MLC in endothelial cells and smooth muscle cellsby P38MAPK, ERK pathway. VE-cadherin and FAK also involve in the process of pulmonary endothelial permeability increasing.

PBEF; cardiopulmanory bypass; pulmonary vascular endothelial; permeability

江西省自然科学基金项目(项目编号：2007G291212)资助；国家自然基金课题《前B细胞克隆增强因子在体外循环术后肺血管内皮通透性增加中的机制研究》资助，项目编号：81260054；国家自然基金《VEGF165/OPG 共价修饰去细胞瓣重构介入心脏瓣膜的抗钙化机制研究》资助，项目编号：81260047)

董啸,主任医师，医学博士，研究方向：心胸外科。

R654.1

A

1007-8517(2014)19-0024-02

2014.08.09)