新生隐球菌通过血脑屏障的机制

李平 聂舒 朱红梅 温海

(上海长征医院皮肤病与真菌病研究所全军真菌病重点实验室第二军医大学附属长征医院皮肤科，上海 200003)

新生隐球菌是一种环境腐生菌，常引起免疫功能受损人群的感染。中枢神经系统感染是隐球菌病最主要的临床表现，常表现为致命性的脑膜炎或脑膜脑炎(Cryptococcal meningitis/meningoencephalitis，CME)，是其高病死率的主要原因。关于隐球菌嗜中枢性机制的研究主要聚焦在血脑屏障与隐球菌作用前后某些基因表达和功能变化等方面，明确了不少促进隐球菌侵袭血脑屏障的关键基因，同时也建立了相对完美的体外血脑屏障模型，本文就有关问题作一阐述。

图1 血脑屏障体外模型示意图［6，8］Fig.1 The in vitro model of blood-brain barrier

1 血脑屏障的体外研究模型

血脑屏障主要由三种细胞组成:脑微血管内皮细胞、星形胶质细胞和周细胞，三者共同组成紧密连接的网状结构，控制血液与中枢神经系统的物质交换。目前常用的体外血脑屏障模型是将单层脑微血管内皮细胞置于Transwell小室中培养［1-7］，再将Transwell小室置于12孔板或6孔板中培养，Transwell小室相当于血管腔一侧，而培养孔则相当于中枢神经系统一侧。研究时将隐球菌加于Transwell小室内，观察其穿过微血管内皮细胞层及Transwell微孔膜进入下方培养孔的能力(见图1)。Transwell小室底部是具有8 μm孔径的微孔膜，模拟了血管的基膜。微孔膜辅以胶原包被，再将血管内皮细胞种植于膜上培养，由于微血管内皮细胞之间可以形成紧密连接，基本上模拟了血脑屏障的结构。目前报道的有用原代人［1-3］、牛［4-5］内皮细胞及永生化的人内皮细胞系HCMEC/D3［6］和小鼠内皮细胞系 bEnd.3［7］。该模型的缺点是忽略了星形胶质细胞和周细胞在血脑屏障中的作用。研究表明，周细胞、星形胶质细胞与内皮细胞的相互作用对维持血脑屏障的功能极其重要，因此，Nakagawa等人在上述模型的基础上构建了新的血脑屏障模型，该模型由大鼠原代脑内皮细胞、周细胞及星形胶质细胞的共培养体系构成［8］。对该模型的研究发现，星形胶质细胞和周细胞均能明显提高内皮细胞的跨内皮电阻(transendothelial electrical resistance，TEER)和降低血管内皮细胞层的通透性，并能诱导内皮细胞紧密连接蛋白的表达。在构建的7个模型中，EPA模型(内皮细胞接种于小室内侧、周细胞接种于小室膜的下侧、星形胶质细胞接种于培养孔内，见图1)紧密连接蛋白表达量最高，跨内皮电阻最大，通透性最低，是最接近正常生理机构的体外血脑屏障模型。

2 影响新生隐球菌通过血脑屏障的因素

2.1 单核细胞

有研究报道，新生隐球菌可以通过木马机制穿越血脑屏障，单核细胞在该机制中发挥了很重要的作用［9］。研究通过预先将单核细胞与隐球菌共培养将隐球菌吞噬，然后将已吞噬隐球菌的单核细胞注射小鼠，发现小鼠脑组织中的真菌荷载量比接种同剂量隐球菌的小鼠要高。给小鼠注射氯磷酸，使单核吞噬细胞耗尽，小鼠大脑菌体载量也降低了40%以上，说明单核细胞在隐球菌感染中枢神经系统的过程中起到了载体的作用。该研究证实了隐球菌可以通过木马机制穿过血脑屏障，但具体机制仍未阐明。

2.2 脑微血管内皮细胞

脑微血管内皮细胞是维持血脑屏障功能最主要的细胞，这些细胞具有非常低的胞吞能力、表达特异性离子和肽转运蛋白，由于毗邻的脑微血管内皮细胞表达紧密连接蛋白，因此可以形成低透水的物理屏障［10］。利用体外血脑屏障模型，多个研究小组证实隐球菌可以通过胞吞转运作用通过血管内皮细胞层，这种穿透作用与宿主细胞的细胞骨架重排有密切联系，也与新生隐球菌表面包被的宿主纤溶酶原的激活有关。

与细胞骨架有关的分子 Rho GTPases的三个主要分子RhoA、Rac1和Cdc42与肌动蛋白细胞骨架的重排有密切关系，很多病原体可以通过调节Rho GTPases的活性影响肌动蛋白的聚合从而黏附和侵袭宿主细胞［3］。研究表明，新生隐球菌可以活化人脑微血管内皮细胞Rho GTPases三个分子RhoA、Rac1和Cdc42，这些分子的活化影响了肌动蛋白细胞骨架的重排进而影响了隐球菌通过血脑屏障。通过显性抑制实验发现，抑制RhoA、Rac1和Cdc42的活性明显降低了隐球菌通过血脑屏障的能力［3］。Rho GTPases的活化同时激活了下游信号分子黏着斑激酶 (FAK)、埃兹蛋白及PKCα，这些信号分子同样影响肌动蛋白骨架的重排，通过干扰RNA敲除这些分子的表达同样明显降低了隐球菌通过脑微血管内皮细胞层的能力，说明新生隐球菌促进内皮细胞Rho GTPases的活化以及其下游信号分子FAK、埃兹蛋白及PKCα的活化有助于隐球菌通过血脑屏障。Maruvada等人的研究也证实了Rac1促进新生隐球菌通过血脑屏障。研究发现，新生隐球菌磷脂酶B1(Plb1)可以活化脑微血管内皮细胞Rac1，活化的Rac1结合STAT3增加，从而促进隐球菌穿越血脑屏障［1］。Plb1突变的菌株不能活化Rac1，并且通过血脑屏障的能力降低，抑制Rac1的活性同样降低了隐球菌通过血脑屏障的能力［1］。我们的研究也发现，另一个可以调节肌动蛋白网络的蛋白S100A10在内皮细胞吞噬隐球菌的过程中具有重要作用，抑制S100A10的表达明显降低了内皮细胞吞噬隐球菌的能力，并且被吞噬的隐球菌出芽率降低、荚膜变厚［11］，说明S100A10的敲除降低了细胞内隐球菌的生长能力。有关S100A10影响内皮细胞的吞噬能力是否进一步影响隐球菌通过血脑屏障的能力还需进一步研究。

尿激酶-纤溶酶 (原)系统 尿激酶是一种纤溶酶原激活剂，能激活体内的纤溶酶原转为纤溶酶，纤溶酶是一种广谱蛋白酶，可以降解纤维蛋白富集的细胞外基质和基膜，并可以活化其他的酶原-蛋白酶系统，影响血管的通透性，从而增强病原体的侵袭能力。研究表明，新生隐球菌表面的受体可以结合宿主来源的纤溶酶原，这种结合能力随着荚膜的增厚而降低［12］，结合纤溶酶原的隐球菌在组织纤溶酶原激活剂 (tPA)的存在下明显增强隐球菌的侵袭细胞外基质的能力。进一步研究发现，结合纤溶酶原的隐球菌与微血管内皮细胞共培养后不需要加入tPA即可促进纤溶酶原转化为纤溶酶，并且侵袭血管外基质的能力明显增强［5］，说明血管内皮细胞可能具有纤溶酶原激活的能力。进一步研究发现，血管内皮细胞与活的隐球菌共培养后可以被诱导表达尿激酶，尿激酶可以活化隐球菌表面结合的宿主纤溶酶原转化为纤溶酶，从而增强隐球菌的侵袭血脑屏障的能力。干扰尿激酶的表达或使用尿激酶特异性抑制剂均阻断了纤溶酶原-纤溶酶的活化，从而降低隐球菌的穿透血脑屏障的能力［4］，说明隐球菌可以利用宿主的尿激酶-纤溶酶(原)系统增强其侵袭血脑屏障的能力。

CD44分子 新生隐球菌CPS1基因可以编码透明质酸合酶，该酶可以合成隐球菌荚膜透明质酸［13］，而透明质酸被认为与隐球菌侵袭血管内皮细胞的能力有关［14］。Jong等研究发现，新生隐球菌透明质酸可以结合人脑微血管内皮细胞的CD44分子，使用CD44中和抗体明显降低了隐球菌黏附人脑微血管内皮细胞的能力，敲除CD44分子或使用透明质酸缺陷的菌株也观察到了类似的结果，说明透明质酸与CD44分子的作用在新生隐球菌入侵脑微血管内皮细胞的过程中发挥了重要的作用［14］。进一步实验发现，过表达CD44分子可以增强新生隐球菌对内皮细胞的黏附，并且通过共聚焦显微镜检测发现，CD44分子富集在隐球菌黏附血管内皮细胞的部位或周围。CD44胞质尾区还能与骨架结合蛋白结合，促进了骨架重组，说明透明质酸与CD44的作用也可能与内皮细胞的骨架重组有关系。

2.3 隐球菌毒力因子

隐球菌入侵中枢神经系统，除了宿主因素，还与隐球菌本身的毒力因子有着密切关系。目前的研究表明，隐球菌的荚膜、尿素酶和CPS1基因有关的透明质酸都与隐球菌的侵袭能力有关。

荚膜 荚膜是公认的隐球菌的毒力因子，Chen SH等人研究发现野生株黏附脑微血管内皮细胞的能力比荚膜突变株强，进一步研究发现，荚膜株B4776(CAP59)和 TYCC38-602(CAP64)在3 h后即能够通过体外脑微血管内皮细胞血脑屏障模型，而对应的荚膜突变株则在6 h后才能通过。研究也观察到了B3501菌株在24 h才能通过体外血脑屏障模型，作者认为这可能是过厚的荚膜降低了其穿过内皮细胞层的能力［15］。也有研究发现，隐球菌通过血脑屏障后其荚膜的结构也相应的发生了改变［16］。有关荚膜影响隐球菌通过血脑屏障的机制还不是很清楚，但荚膜能影响隐球菌穿透血脑屏障是毋庸置疑的。

尿素酶 尿素酶是胃肠道和泌尿道感染的病原菌的主要的毒力因子之一，可以促使这些病原菌在低PH环境下存活，也是某些氮源性腐败物转化所需要的酶。尿素酶也被认为是隐球菌的毒力因子［17］。将H99来源的尿素酶缺陷株 (ure1)与野生株分别接种小鼠，ure1的死亡率明显降低。所有接种H99的小鼠死后其脑组织的真菌荷载很高，而ure1组6只小鼠仅有2只小鼠脑组织中可以检测到隐球菌，进一步研究证实尿素酶不是隐球菌在中枢神经系统中生存必需的酶。通过与脾脏及其他器官的真菌荷载比较，尿素酶的缺陷只影响隐球菌侵袭中枢神经系统的能力［18］，说明隐球菌可以利用自身的尿素酶穿透血脑屏障。

CPS1-透明质酸 新生隐球菌CPS1基因与荚膜透明质酸的合成密切相关，CPS1缺陷菌株透明质酸的合成受阻，菌的毒力明显降低。采用4-甲基伞形酮(4-MU)或透明质酸酶处理隐球菌，抑制或破坏其荚膜透明质酸，发现隐球菌黏附人脑微血管内皮细胞的能力明显降低，说明CPS1控制合成的透明质酸影响隐球菌侵袭血脑屏障的能力［13］。在隐球菌侵入脑血管内皮细胞过程中，CPS1-CD44-PKcα-actin细丝的信号通路发挥了重要作用［19］。

2.4 其他因素

HIV-1 gp41是一种HIV-1跨膜蛋白，通过介导HIV病毒与靶细胞膜的融合促进病毒侵人宿主。研究表明，HIV-1 gp41蛋白可以增强新生隐球菌入侵脑微血管内皮细胞［20］，其功能域位于579-611氨基酸。重组 gp41-I90(氨基酸550-639)蛋白也可提高隐球菌黏附内皮细胞的能力，表明HIV-gp41胞外域和新生隐球菌可能以类似的机制侵袭内皮细胞，即actin重组和 (或)膜活化。进一步的研究表明，新生隐球菌和gp41-I90都能上调脑微血管内皮细胞ICAM-1的表达，并能诱导内皮细胞膜的边缘波动。HIV-1 gp41还能诱导CD44和β-actin再分布至膜的脂筏，但与新生隐球菌不同的是，HIV-1 gp41不能诱导PKCα的活化［21］，揭示了在艾滋病患者中，新生隐球菌侵袭中枢神经系统存在新的机制。

3 展 望

新生隐球菌具有嗜中枢神经系统的特性，一方面与隐球菌穿过血脑屏障的能力有关，另一方面肯定与中枢神经系统的环境适合隐球菌生长有关。目前的研究重点主要集中在血脑屏障与新生隐球菌作用后功能的改变，明确了尿激酶-纤溶酶原系统、Rho GTPases以及透明质酸-CD44的重要作用，后两者均与actin骨架重排有关。有关actin骨架结构的改变如何影响新生隐球菌通过血脑屏障的机制尚未明确，有研究表明，CD44的侧向迁移的能力与actin的骨架结构有密切关系，破坏actin细胞骨架明显降低了CD44的侧向迁移能力［14］，而脑微血管内皮细胞与新生隐球菌作用后CD44的极向转移在识别新生隐球菌表面的透明质酸中发挥了重要的作用，那么 Rac1、RohA、Cdc42以及S100A10是否通过影响actin骨架进而影响CD44的极化，从而影响内皮细胞对隐球菌的黏附、吞噬?阐明这些问题将有助于中枢神经系统隐球菌病的防治，其具体机制仍需我们进一步研究。

［1］Maruvada R，Zhu L，Pearce D，et al.Cryptococcus neoformansphospholipase B1 activates host cell Rac1 for traversal across the blood-brain barrier［J］.Cell Microbiol，2012，14(10):1544-1553.

［2］Chang YC，Stins MF，McCaffery MJ，et al.Cryptococcal yeast cells invade the central nervous system via transcellular penetration of the blood-brain barrier［J］.Infect Immun，2004，72(9):4985-4995.

［3］Kim JC，Crary B，Chang YC，et al.Cryptococcus neoformansactivates RhoGTPase proteins followed by protein kinase C，focal adhesion kinase，and ezrin to promote traversal across the bloodbrain barrier［J］.J Biol Chem，2012，287(43):36147-36157.

［4］Stie J，Fox D.Induction of Brain Microvascular Endothelial Cell Urokinase Expression byCryptococcus neoformansFacilitates Blood-Brain Barrier Invasion［J］.PLoS One，2012，7(11):e49402.

［5］Stie J，Fox D.Blood-brain barrier invasion byCryptococcus neoformansis enhanced by functional interactions with plasmin［J］.Microbiology，2012，158(Pt 1):240-258.

［6］Vu K，Weksler B，Romero I，et al.Immortalized human brain endothelial cell line HCMEC/D3 as a model of the blood-brain barrier facilitatesin vitrostudies of central nervous system infection byCryptococcus neoformans［J］.Eukaryot Cell，2009，8(11):1803-1807.

［7］Huppert J，Closhen D，Croxford A，et al.Cellular mechanisms of IL-17-induced blood-brain barrier disruption［J］.FASEB J，2010，24(4):1023-1034.

［8］Nakagawa S，Deli MA，Kawaguchi H，et al.A new blood-brain barrier model using primary rat brain endothelial cells，pericytes and astrocytes［J］.Neurochem Int，2009，54(3-4):253-263.

［9］Carline C，Kirsten N，Samira D，et a1.Evidence of a role for monocytes in dissemination and brain invasion byCryptococcus neoformans［J］.Infect Immun，2009，77(1):120-127.

［10］Huber JD，Egleton RD，Davis TP.Molecular physiology and pathophysiology of tight junctions in the blood-brain barrier［J］.Trends Neurosci，2001，24(12):719-725.

［11］Chen Y，Chen J，Wen H，et al.S100A10 downregulation inhibits the phagocytosis ofCryptococcus neoformansby murine brain microvascular endothelial cells［J］.Microb Pathog，2011，51(3):96-100.

［12］Stie J，Bruni G，Fox D.Surface-associated plasminogen binding ofCryptococcus neoformanspromotes extracellular matrix invasion［J］.PLoS One，2009，4(6):e5780.

［13］Jong A，Wu CH，Chen HM，et al.Identification and characterization of CPS1 as a hyaluronic acid synthase contributing to the pathogenesis ofCryptococcus neoformansinfection［J］.Eukaryot Cell，2007，6(8):1486-1496.

［14］Jong A，Wu CH，Shackleford GM，et al.Involvement of human CD44 duringCryptococcus neoformansinfection of brain microvascular endothelial cells［J］.Cell Microbiol，2008，10(6):1313-1326.

［15］Chen SH， Stins MF， Huang SH，et al.Cryptococcus neoformansinduces alterations in the cytoskeleton of human brain microvascular endothelial cells［J］.J Med Microbiol，2003，52(Pt 11):961-970.

［16］Charlier C，Chrétien F，Baudrimont M，et a1.Capsule structure changes associatedCryptococcus neoformanscrossing of the blood-brain barrier［J］.Am J Pathol，2005，166(2):421-432.

［17］Cox GM，Mukherjee J，Cole GT，et al.Urease as a virulence factor in experimental cryptococcosis［J］.Infect Immun，2000，68(2):443-448.

［18］Olszewski MA，Noverr MC，Chen GH，et a1.Urease expression by Cryptococcus neoforms promotes microvascular sequestration，thereby enhancing central nervous system invasion［J］.AmJ Pathol，2004，164(5):1761-1771.

［19］Jong A，Wu CH，Prasadarao NV，et al.Invasion ofCryptococcus neoformansinto human brain microvascular endothelial cells requires protein kinase C-alpha activation［J］.Cell Microbiol，2008，10(9):1854-1865.

［20］Jong AY，Wu CH，Jiang S，et al.HIV-1 gp41 ectodomain enhancesCryptococcus neoformansbinding to HBMEC［J］.Biochem Biophys Res Commun，2007，356(4):899-905.

［21］Huang SH，Wu CH，Jiang S，et al.HIV-1 gp41 ectodomain enhancesCryptococcus neoformansbinding to human brain microvascular endothelial cells via gp41 core-induced membrane activities［J］.Biochem J，2011，438(3):457-466.