黄芩素与氟康唑协同抗白念珠菌生物被膜作用研究

赵柳娅 蒋京辰 姚响文 曹颖瑛 姜远英

(1.第二军医大学药学院新药研究中心，上海 200433;2.中国药科大学药理学教研室，南京 210009)

近年来，随着临床广谱抗菌药物、糖皮质激素以及免疫抑制剂等药物的大量使用，各种介入治疗、器官移植等技术的广泛开展，真菌感染的患者不断增多［1］。真菌感染中以白念珠菌 (Candida albicans)比较最高，患者在机体免疫力低下时容易感染，可导致念珠菌阴道炎、念珠菌血症、鹅口疮等疾病。白念珠菌对环境有很强的适应能力，可以在体内植入的人工器官或导管等生物材料表面形成生物被膜(biofilm)，这是一种由基底芽生孢子层、菌丝成分和细胞外多聚基质三部分构成的白念珠菌结构群体。白念珠菌生物被膜的形成是导致临床致病真菌反复感染的重要原因［2］。目前临床对白念珠菌的生物被膜尚无理想对策，一旦发生，通常不得不取出人工的医疗装置［2］。氟康唑(fluconazole，FLC)等唑类抗真菌药物是治疗念珠菌病的一线药物，但FLC仅对浮游型白念珠菌有很好的抑制作用，生物被膜型白念珠菌对FLC具有很强的耐药性，已成为困扰临床治疗的一个重要问题。

黄芩素 (黄芩苷元，Baicalein，BE)是从唇形科植物黄芩的干燥根中提取的有效成份之一。黄芩是常用中药，其味苦、性寒，归肺、心、肝、胆、大肠经，具有清热燥湿、泻火解毒、止血安胎等功效。黄芩素具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗病毒等药理活性，且对血液细胞及肝脏细胞等正常细胞无毒性［3-9］。虽然有研究报道黄芩素具有抗真菌活性，但由于其活性较弱，一直未应用于临床。目前，也尚未有BE与唑类抗真菌药物协同抗白念珠菌生物被膜作用的报道。本实验构建白念珠菌生物被膜，应用XTT法测定生长动力学，研究BE与FLC协同抗白念珠菌生物被膜的作用，为临床治疗白念珠菌生物被膜提供了新的安全、有效的联合用药方案。

1 材料和方法

1.1 菌株

白念珠菌国际标准株SC5314由William A.Fonzi(Department of Microbiology and Immunology，Georgetown University，Washington，D.C.)惠赠。

1.2 培养基和试剂

培养基 RPMI 1640培养液:RPMI 1640(Gibco BRL 公司)10 g，NaHCO32 g，吗啡啉丙磺酸(morpholine propanesulfonic acid，MOPS，Sigma 公司)34.5 g，加去离子水900 mL溶解，用1 mol/L NaOH调pH至7.0，去离子水加至1 000 mL，滤过消毒，4℃保存。YPD培养液:酵母浸膏10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，加去离子水900 mL溶解，蒸馏水加至1 000 mL，高压灭菌后4℃保存。PBS缓冲液:NaCl 8.0 g，KCl 0.4 g，Na2HPO40.133 g，KH2PO40.06 g，NaHCO30.35 g，加去离子水定容至 1 000 mL，高压灭菌后4℃保存。

试剂 氟康唑(Fluconazole，FLC)注射液由上海信谊金朱药业有限公司提供，黄芩素(Baicalein，BE)和XTT购自Sigma公司，FUN-1和ConA购自Molecular Probe公司，2×SYBR Premix ExTaq购自Takara公司。

1.3 实验仪器与装置

Eppendorf 5417R高速冷冻离心机 (Eppendorf)，SW-CT-IF型超净化工作台 (苏州安泰空气技术有限公司)，HZQ-F160恒温振荡培养箱 (江苏省太仓市实验设备厂)，96孔细胞培养板 (Nunclon)，激光共聚焦显微镜 (Leica TCS sp)，light Cycler System实时定量Real Time RT-PCR仪，Gene Quant II核酸定量分析仪。

1.4 白念珠菌生物被膜的形成

按照文献方法进行白念珠菌生物被摸的培养［10］。自含有新鲜生长白念珠菌的YPD琼脂平板上挑取单克隆接种于YPD培养基，30℃振荡培养过夜 (约16 h)。次日离心收集细胞，PBS洗涤3次，重悬于RPMI 1640培养基，以血球计数板计数，调整细胞浓度至1.0×106cells/mL，加入塑料组织培养瓶或培养板内，37℃静置1 h，弃上清，重新加入 RPMI 1640(含或不含 BE和 FLC)，37℃孵育24 h。

1.5 XTT法测定生物被膜的生长动力学

白念珠菌生物被膜的生长动力学检测采用XTT法［10］。XXT是一种MTT类似的四唑氮衍生物，该化合物是线粒体脱氢酶的作用底物，可被活细胞线粒体脱氢酶还原成水溶性的棕色甲肷产物，甲肷产物的吸光度与活细胞的数量成正比。取出上述药物处理并培养的白念珠菌生物被膜，PBS洗去未黏附细胞，加入XTT-甲萘醌溶液，于37℃黑暗中放置2 h，用酶标仪492 nm处测定吸收度值。

1.6 激光共聚焦显微镜 (CSLM)观察生物被膜

将白念珠菌在塑料培养板中按照生物被膜形成条件培养48 h后，加入含有10 μM FUN-1和25 μg/mL ConA的PBS，37℃孵育45 min，以激光共聚焦显微镜观察生物被膜形成状况。

1.7 细胞表面疏水性 (Cell Surface hydrophobicity，CSH)测定

白念珠菌细胞表面疏水性采用水-烃两相测定实验［11］。刮取细胞以YPD制备成悬液 (OD600=1.0)，每组取1.2 mL悬液置于一洁净玻璃管内，加入0.3 mL正辛烷。旋涡混匀3 min，静置待两相分离。两相分离后立即测定水相的OD600值。以不加正辛烷的YPD培养基的OD600值作为阴性对照。CSH计算方法为:相对疏水性=(OD600对照-OD600实验)/OD600对照。

1.8 总 RNA的提取及实时定量 Real Time RTPCR实验

采用一步法抽提白念珠菌总 RNA［12］，检测OD260和OD280值，考察所提RNA的质量，并反转录成cDNA。实时定量Real Time RT-PCR循环参数为:95℃ 10 s(变性)，60℃ 20 s(退火)，72℃ 15 s(延伸)，重复40个循环。熔解曲线 (melting curve program)使用 60 ～95℃，加热速率 0.1℃ /s。以18S rRNA做为内参标准，结果应用软件Light Cycler system software version 3.5(Roche Diagnostics)进行分析。基因表达水平用倍数变化来表示(2-ΔΔCt法)。实验中所用引物序列见表 1。

表1 实验中引物序列Tab.1 Primers sequence used for Real Time RT-PCR in this study

1.9 统计学处理

所有实验结果均来自至少3组平行或3次重复实验，实验所得数据采用SPSS 16.0分析软件进行分析，数据以平均值±标准误 (Mean±S.E.M)表示。

2 结 果

2.1 白念珠菌生物被膜的形态观察

为了比较经BE单独及联合FLC处理的白念珠菌生物被膜形态的差异，将含有BE或FLC及两者联用的白念珠菌在生物被膜培养条件下培养24 h，以FUN-1(可被具代谢活性的细胞转变成橙红色，染胞浆)和ConA(可结合白念珠菌细胞壁多糖上的葡萄糖和甘露糖残基发出绿色荧光，染胞壁)染色后，激光共聚焦显微镜观察显示:正常白念珠菌生物被膜中含有大量菌丝，经16 g/mL FLC单独处理的白念珠菌生物被膜与正常组无显著差异，4 g/mL BE单独处理的白念珠菌生物被膜受到一定程度的抑制作用，菌丝减少，而当16 g/mL FLC联合4 g/mL BE处理时白念珠菌生物被膜明显受到抑制，结构疏松，菌丝成分明显减少，极易从附着物上脱落 (见图2)。

2.2 BE与FLC协同抑制白念珠菌生物被膜形成的作用

白念珠菌生物被膜黏附1 h后，用4 g/mL BE、16 g/mL FLC单独及两者联合处理白念珠菌，24 h后XTT法测定生物被膜的生长动力学，结果表明，BE与FLC联用对白念珠菌生物被膜形成抑制能力增强，16 g/mL的FLC对白念珠菌生物被膜的抑制率为27%，4 g/mL的BE对白念珠菌生物被膜的抑制率为43%，16 g/mL的FLC联合4 g/mL BE可对白念珠菌生物被膜的抑制率达91%(见图3a)。白念珠菌生物被膜培养24 h后，用4 g/mL BE、16 g/mL FLC单独及两者联合处理白念珠菌，再经24 h后XTT法测定生物被膜的生长动力学，结果表明，BE与FLC联用对白念珠菌生物被膜形成抑制能力增强，16 g/mL的FLC对白念珠菌生物被膜的抑制率仅为4%，4 g/mL的BE对白念珠菌生物被膜的抑制率为15%，16 g/mL的FLC联合4 g/mL BE可对白念珠菌生物被膜的抑制率可达55%(见图3b)。

2.3 BE与FLC联用对白念珠菌生物细胞表面疏水性及相关基因表达的影响

刮取经BE、FLC单独及两者联合处理的白念珠菌生物被膜，测定CSH值，结果可见，在FLC浓度为16 g/mL时，白念珠菌的 CSH值为0.92，BE浓度为4 g/mL时，白念珠菌的CSH值为0.65，经16 g/mL FLC与4 g/mL BE联合处理的白念珠菌CSH值仅为0.08(见图3)。采用实时定量 RTPCR法测定白念珠菌CSH相关基因CSH1、菌丝形成调控基因EFG1、黏附相关基因HWP1、ALS1的mRNA表达水平，结果表明，与单用组相比，经BE与FLC联合处理的白念珠菌 CSH1、EFG1、HWP1基因表达水平明显下调，ALS1基因表达水平上调(见图4)。

3 讨 论

白念珠菌生物被膜形成的一个重要后果是对一些临床常用抗真菌药物产生高度耐药性。有研究报道，白念珠菌形成生物被膜后对氟康唑、两性霉素B的敏感性下降几百倍、几十倍［13-16］。目前，尚无有效的抗真菌药物可对抗白念珠菌生物膜产生的耐药性。筛选出一些自身无抗真菌生物被膜活性或者活性较弱、但能对抗真菌药物有协同作用的药物并与之联合使用将显然是一个捷径，将有广泛的临床应用前景。

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黄芩素具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗癌、抗病毒等药理活性，但有关其抗真菌作用的报道很少。而黄芩素作为天然活性成分，其植物资源丰富，不良反应少见，所以黄芩素与唑类抗真菌药物氟康唑的协同作用为抗真菌治疗提供了安全有效的用药新思路。

白念珠菌生物被膜形成主要包括三步:黏附、生物被膜生长及成熟，其中细胞的起始黏附对生物被膜的形成非常重要。CSH是白念珠菌重要的毒力因子之一，已有实验表明，CSH在白念珠菌生物被膜形成中起重要作用，CSH值越大，生物被膜形成能力越强［17-18］。CSH1编码一种细胞表面疏水性相关蛋白，是第一个被发现的可影响白念珠菌CSH表型的候选基因，敲除该基因后白念珠菌的细胞表面疏水性下降［19］。EFG1能够增强菌丝生长能力，在酵母向菌丝转化的调控中起着重要作用，是调节酵母向菌丝转换的关键调控基因。EFG1基因突变时，在诱导菌丝形成的培养基中，菌丝形成均减少，菌丝特异基因表达下降，菌株致病力降低［20］。ALS1、HWP1 基因是白念珠菌黏附素家族的成员，在白念珠菌黏附中起重要作用。白念的黏附是定居和侵袭的先决条件，所以对白念黏附的研究是至关重要的［21］。本实验中我们测定了经BE单用、FLC单用及两者联合处理的白念珠菌生物被膜的CSH及白念珠菌黏附、细胞表面疏水性、菌丝生长相关基因表达水平，结果表明，白念珠菌生物被膜经BE联合FLC处理后，CSH值降低，CSH1、EFG1、HWP1基因表达水平下调，而ALS1基因表达水平上调，提示上述基因表达水平改变而导致的细胞表面疏水性降低、菌丝形成减少、黏附能力降低是BE与FLC协同抑制白念珠菌生物被膜形成的重要分子机制。

综上所述，黄芩素与氟康唑联用对白念珠菌生物被膜的形成具有抑制作用，其抑制机制涉及改变白念珠菌细胞表面疏水性、菌丝形成及黏附相关基因mRNA的表达水平，从而降低其细胞表面疏水性、减少菌丝形成，降低细胞黏附能力。黄芩素与氟康唑协同抗白念珠菌生物被膜作用为临床治疗白念珠菌生物被膜提供了新的安全、有效的联合用药方案。

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