SD大鼠大椎穴BDA神经通路示踪研究

云南中医学院，云南 昆明 650500

SD大鼠大椎穴BDA神经通路示踪研究

和凤军唐柱生吴冠儒陈学秋李启勇宋波郝敬红黄利民

云南中医学院，云南 昆明 650500

目的探讨大椎穴神经传导通路及其与周围非穴位区神经通路有无差异，为针刺大椎穴治疗疾病机理与神经调节的相关性提供形态学依据。方法将12只SD大鼠分成实验组和对照组，每组6只。大椎穴组(实验组)和第6～7颈椎棘突间组(对照组)分别于大椎穴和第6、7颈椎棘突之间注射15%BDA，10μl/只，所有实验大鼠注射后存活7天，行灌注固定取脑和脊髓，4%多聚甲醛固定，30%蔗糖-0.1M PBS液沉底，取脊髓C1-C4和脑干行片厚10μm冰冻切片，免疫组化反应，DAB显色，观察各组脑干和脊髓内阳性细胞的分布特点和差异。结果BDA阳性细胞呈棕黄色，胞核淡染，胞质和突起染色深。在脊髓C1-C4节段灰质前角、后角、灰质联合、网状结构均可见到数量不等、大小不一的阳性细胞，其中实验组各部的阳性细胞均多于对照组，组间比较差异明显有统计学意义；中脑内红核和中央尾叶核均可见阳性细胞，其中实验组阳性细胞明显多于对照组，差异有统计学意义。结论BDA可以跨神经元逆行转运，是穴位神经通路示踪的可靠神经示踪剂；大椎穴及其周围非穴位区神经通路在脊髓上颈节段和中脑传导路径相似，但是各部的阳性细胞数量有差异，实验组阳性细胞明显多于对照组，其机理和详细神经通路有待进一步深入研究。

SD大鼠；大椎穴；神经通路示踪；BDA

大椎穴是中医临床常用的穴位,可用于治疗感冒、哮喘、发热、失眠、椎-基底动脉供血不足、颈椎病、痤疮、带状疱疹、白细胞减少症、急性扁桃体炎、咽炎、糖尿病性周围神经病变、高血压等[1]，是治疗疾病、保健养生的要穴。但是，针刺或艾灸大椎穴治疗以上疾病的具体机理还不完全清楚。目前普遍认为神经系统-免疫系统-内分泌系统之间存在相互调节，相互影响，共同构成人体调节网络。本研究通过用生物素葡聚糖胺(Biotinylated-dextran amine，BDA)对SD大鼠大椎穴神经通路进行示踪，以期探讨该穴位区与中枢神经之间的神经通路联系，这将有助于从神经调节角度探讨针刺或艾灸大椎穴治疗疾病的机理，为阐明针刺大椎穴治疗疾病的相关机理提供形态学依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组 SD大鼠12只 雌雄各6只，四川省医学科学院实验动物研究所，许可证号(合格证号)SCKK(川)2004-16，SCXK(川)2005-00010Q。分为大椎穴组(实验组)和第6～7颈椎棘突间组(对照组)两组，每组各6只。

1.2 注射方法 按林文注[2]大鼠大椎穴“在第7颈椎与第1胸椎间，背部正中”定位，25%乌拉坦按0.3ml/100g体重腹腔注射麻醉，以隆椎为体表标志，剪去项背部正中皮毛，定位清楚后实验组在大椎穴注射15%BDA，10μl/只，与棘突间平行进针，深度约5mm，注射完后留针10min；对照组于项部正中，第6～7颈椎棘突间注射15%BDA，10μl/只，与棘突间平行进针，深度约5mm，注射完后留针10min。两组实验大鼠注射神经示踪剂后笼养存活7天。

1.3 试剂及仪器 神经示踪剂Neuro Trace TM BDA-10,000 Neuronal Tracer Kit，U.S.A. 含：①10，000Mw BDA(A剂)，冻干BDA 3mg/瓶×6瓶，②avidin-HRP(B剂)，冻干avidin-HRP 100μg/瓶×6瓶，③DAB(C剂)，250mg/瓶×1瓶。于-200C～-800C冰箱干燥避光保存，购自北京中杉金桥；DAB显色试剂盒(20×)3ml,ABC各3ml，A浓缩缓冲液，B浓缩DAB溶液，C浓缩过氧化氢溶液；乌拉坦(氨基甲酸乙酯，国药集团化学试剂有限公司生产)；PBS磷酸盐缓冲液ZLI-9062 2000ml/袋(0.01M PH 7.2～7.4)，北京中杉金桥生物技术有限公司生产；France Millipore 超纯水系统；Leica CM 1900冰冻切片机；Motic BA310-Moticam Pro282A病理图像分析系统。

1.4 灌注取材 大鼠称重，按25%乌拉坦0.3ml/100g体重腹腔注射麻醉，仰卧位将大鼠四肢和头部固定在自制大鼠固定板上，从上腹部剪开皮肤至颈部，向两侧分离皮肤暴露胸部肌肉，从剑突两侧依次向嘴侧剪开膈、肋和肋间肌，向嘴侧翻起胸骨及其连带组织，充分暴露胸腺、心包和肺。将输液针从心尖刺入插至升主动脉，先灌注生理盐水约130ml，剪开右心房排血至流出清亮液体，再灌注4%多聚甲醛约250ml至大鼠四肢和尾巴坚硬为止。将固定好的大鼠取俯卧位固定，从后正中线由尾侧向嘴侧剪开皮肤并向两侧分离，从棘突两侧切开分离肌肉充分暴露脊柱棘突、肋、枕骨、颅顶骨，从第四腰椎棘突平面始，用小止血钳咬开棘突、椎板暴露椎管和马尾，用细头止血钳轻轻插入椎管由横突水平从尾侧到头侧方向夹除椎弓板及横突显露脊髓，在头部正中用手术刀背沿正中线划数下，用剪子轻钻一个小洞，从小洞用止血钳向两侧撑开颅骨暴露脑，用止血钳夹除延髓和脊髓交界处枕骨充分暴露脑和脊髓，从尾侧提起脊髓，剪除两侧前后根丝等脊髓与椎管间的连结组织、剪除与脑相连的脑神经根，将脑和脊髓一起取出置入4%多聚甲醛中存储。

1.5 切片及染色 取脑干和上颈段C1-C4脊髓30%蔗糖沉底，行片厚10μm冰冻切片。0.01MPBS液漂洗切片3次，10min/次→切片入1.0μg/ml Avidin-HRP液中，40C冰箱湿盒过夜→PBS液漂洗切片3次，10min/次→0.003%DAB显色时间3～5 min，有反应后用蒸馏水终止DAB显色→梯度上行酒精脱水(70%Alc→80%Alc→90%Alc→95%Alc→100%AlcⅠ→100%AlcⅡ，5～10min/次)→二甲苯透明(二甲苯Ⅰ→二甲苯Ⅱ，5～10min/次)→中性树胶封片。

1.6 观察分析 在显微镜下，观察脑干和脊髓上颈段切片中阳性细胞和阳性纤维的分布情况。Motic 病理图像分析系统下拍片。两组大鼠脑干和脊髓上颈段切片分别各取40片，在×200倍显微镜下计数阳性细胞。

2 结果

BDA阳性细胞呈棕黄色，胞核淡染，胞质和突起染色深。在两组大鼠脊髓C1-C4节段灰质前角、后角、灰质连合、网状结构均可见到数量不等、大小不一的阳性细胞(见图①-⑧)，其中实验组各部的阳性细胞均多于对照组，组间比较差异明显有统计学意义(具体见表1)。

灰质前角(个)灰质后角(个)灰质连合(个)网状结构(个)实验组35±6 60☆28 1±1 87☆17 4±2 03☆16 8±2 30☆对照组29 6±1 2718 6±2 8813 4±1 5812 9±0 99

注：与对照组比较，☆P<0.05。

脊髓前角可见大、中、小阳性细胞，大细胞多见于前角尖，后角可见少量小阳性细胞，背外侧索见密集纤维。中央管前后灰质连合见大量中、小阳性细胞，网状结构见中多个小细胞，胞核淡染，细胞呈梭形或多角形，可见明显的突起。

中脑内红核和中央尾叶核均可见阳性细胞(见图a-d)，其中实验组阳性细胞明显多于对照组，差异有统计学意义。

3 讨论

BDA是一种与生物素结合的多聚葡萄糖胺，可用于顺行和逆行示踪，由Glover等[3]于1986年首次成功地运用在神经束路追踪中。陈亚亮[4]等应用BDA法成功地显示了大鼠脊髓小脑束、前庭束纤维在小脑中央核及前庭核中的投射。

本次实验采用BDA进行大椎穴及其周围非穴位区神经通路示踪，两组均于脊髓和脑干清楚显示了BDA阳性细胞，提示BDA是穴位神经通路示踪的可靠示踪剂，可以逆行跨神经元示踪；且实验组的阳性细胞明显多于对照组，可能与大椎穴处感受器、运动神经末梢比非穴位区密集有关，提示大椎穴治疗疾病与神经调节有一定的相关性。鉴于本次研究资料有限，大椎穴与延髓、脑桥、脊神经节、颈交感神经节、小脑、下丘脑等的神经通路联系还有待进一步研究。大椎穴左、右旁开处、第7颈椎与第1胸椎棘突间与大椎穴神经通路有无差异还需要进一步探讨。相信随着研究的深入，项目组可以阐明大椎穴与中枢神经联系的神经通路，为大椎穴治疗疾病与神经调节相关性提供形态学依据。

[1]翟景慧,李晓泓,李辉,等.近年大椎穴临床研究概况. 北京中医,2004, 23(3):186-188.

[2]林文注，王佩.实验针灸学.上海科学技术出版社,1999，9：288.

[3]Glover J C, Petursdottir G, Jansen J K S. Fluorescent dextran-amines as neuronal tracers in the nervous system of the chicken embryo. J Neurosci Method, 1986,18:243～254.

[4]陈亚亮,李 莉,高秀来. BDA法神经束路追踪技术. 首都医科大学学报,2002,23(3):258-260.

云南省教育厅科学研究基金项目(立项)资助，项目编号：06Y318C。

和凤军(1970-)，男，纳西族，医学硕士，副教授，主要从事解剖、组胚学教学与科研。

R33-33

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1007-8517(2014)13-0038-02

2014.05.08)