辣蓼醇提液对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg和HBeAg 的影响

1.桂林市中医院，广西 桂林 530001；2.桂林医学院，广西 桂林 541004

辣蓼醇提液对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg和HBeAg的影响

李明1刘笑甫2张可锋2

1.桂林市中医院，广西 桂林 530001；2.桂林医学院，广西 桂林 541004

目的研究辣蓼醇提液对HepG2.2.15细胞分泌乙型肝炎表面抗原(HBsAg) 和乙型肝炎e抗原(HBeAg) 的影响。方法采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测辣蓼醇提液对HepG2.2.15细胞的细胞毒作用；采用药物不同浓度处理HepG2.2.15细胞72h后，以酶联免疫吸附实验法(ELISA 法)测定细胞上清液中HBsAg和HBeAg的分泌水平。结果辣蓼醇提液浓度为1.8、0.9mg/ml时，对细胞有明显毒性；浓度为0.6、0.3、0.1 mg/ml的辣蓼醇提液处理HepG2.2.15细胞株72h后，对 HBsAg、HBeAg 的分泌有抑制作用(P<0.05)，并呈量效关系。结论辣蓼醇提液具有体外抗HBV的作用，同时有一定毒性。

辣蓼；HepG2.2.15；HBsAg；HBeAg

辣蓼为蓼属植物辣蓼PolygonumflaccidumMeism.，以全草入药。其具有祛风利湿，散瘀止痛，解毒消肿，杀虫止痒的作用。临床用于痢疾、胃肠炎、腹泻、风湿关节痛、跌打肿痛、功能性子宫出血；外用治疗毒蛇咬伤、皮肤湿疹等[1]。辣蓼药材资源丰富，我国西南各省均产，为民间常用防治肝炎的中草药之一。本实验通过观察辣蓼醇提液对HepG2.2.15细胞的抑制作用，为进一步开发高效、价廉、疗效确切的治疗肝脏疾病的药物提供理论依据，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物 辣蓼药材2008年秋季采于广西南宁高峰林场，经广西中医学院韦松基教授鉴定，为蓼科植物辣蓼PolygonumPerfoliatumL. 的全草。样品低温干燥后，粉碎成粗粉，备用。

1.1.2 试剂 PBS磷酸缓冲盐(福州迈新生物技术开发有限公司，批号：09030901)；胰蛋白酶1∶250(美国Amresco，批号：351813039)；PPM1 培养液(美国GIBCO，批号：810815)；MTT(美国Amresco，进口分装)；二甲基亚砜 (美国Sigma，批号: 20080329)；乙型肝炎病毒表面抗原、核心抗原ELISA试剂盒(均购自上海科华生物技术有限公司，批号分别为20080320；20081030)。

1.1.3 细胞株 人肝癌细胞2.2.15细胞系(简称HepG 2.2.15细胞)，购于美国Mount Sinai医学中心，再自行传代培养。

1.1.4 仪器 AUW220D电子天平(日本岛津公司)；303-0型电热温培养箱(济南云成仪器有限公司)；SW-CJ-1FDA型超净工作台(江苏苏净集团)；MCO-15AC型二氧化碳培养箱(日本SANYO公司)；TS100-F型倒置显微镜(日本NIKON公司)；ELX800型全自动酶标仪(美国 BIO-Tek公司)。

1.2 方法

1.2.1 辣蓼醇提液的提取与配制 将称取的辣蓼药材粉末10.0g倒入250mL圆底烧瓶中，加入100mL 70%乙醇水浴连续回流提取2次，每次1h，将回流液合并，滤过，得到提取液。将提取液于60 ℃挥干提取溶剂。以适量二甲基亚砜助溶，配成浓度为0.67g/ml的药液，0.22 μm无菌微孔滤器滤过，然后将滤过后的无菌药液用DMEM细胞培养液配成浓度为0.5、1.5、2.5、4.5、9、18 mg/ml的药液，置于4℃冰箱中保存待用。

1.2.2 磷酸盐缓冲溶液PBS的配制 称7.9g NaCl，0.2g KCl，0.24g KH2PO4和1.8g K2HPO4溶于800 ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1 L，再经高温高压(121℃，30min)灭菌后，保存于4℃冰箱中待用。

1.2.3 消化液的制备 称取0.25g胰酶(sigma-aldrich)，加入到100ml PBS溶液中，搅拌混匀，避免出现泡沫(损坏蛋白)，过滤除菌，置于4℃冰箱中待用。

1.2.4 HepG2.2.15细胞株的复苏与培养 从液氮容器中取出细胞株HepG2.2.15的冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其细胞株尽快融化；从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，并加入10倍以上的培养液，混匀，1000rpm/min离心5min，弃去上清液，加入DMEM完全培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养，根据细胞生长情况，1～3d 更换培养液。细胞长满培养瓶后，将细胞进行传代，吸弃原培养液，用0.25%的胰酶对细胞进行消化，再用完全培养基终止消化，轻轻吹打成单细胞，按1∶3传代。细胞再次长满后，进行消化，计数，调整细胞浓度为1×104个/ml，接种于96孔细胞培养板上，于37℃培养箱中培养24h，进行后续实验。

1.2.5 药物对细胞毒性MTT实验 加入辣蓼醇提液，使其终浓度分别为1.8、0.9、0.6、0.3、0.1、0.05mg/L，同时设细胞对照组。每个浓度设5个复孔。药物处理72h后，加入浓度为5mg/ml的MTT 20 μl继续培养4h。吸弃上清液，用PBS缓冲溶液清洗2次，每孔加入二甲基亚砜150μl，室温振荡10min。在490nm处测定吸光值(OD)，计算出药物对细胞破坏率。

1.2.6 抗原抑制作用实验 依据药物毒性实验的结果，将药物浓度设为0.6、0.3、0.1、 0.05mg/mL，每个浓度做3个复孔，同时设细胞对照组。 待药物作用72h后，酶标吸取上清液置培养板上，-20 ℃冷冻备用。采用ELISA法检测上清液中 HBsAg、HBeAg的表达 ，计算辣蓼对抗原的抑制百分率。

2 结果

2.1 辣蓼醇提液对HepG2.2.15细胞的毒性作用 当药液浓度为1.8、0.9和0.6mg/mL时，对细胞的破坏率高达67.28% 、45.22%和27.55%，有明显毒性；当药液浓度为、0.3、0.1、0.05 mg/ml时，破坏率分别为14.36%、12.91%和12.14%，毒性不明显。

2.2 辣蓼醇提液对HepG2.2.15细胞 HBsAg、HBeAg 分泌的影响 实验结果表明，与细胞对照组比较，药物处理HepG2.2.15细胞株72h后，辣蓼醇提液0.6、0.3、0.1mg/ml对HepG2.2.15细胞株的 HBsAg、HBeAg 的分泌有一定抑制作用，差异具有统计学意义(P<0.05)，并呈一定的量效关系。结果见表1。

表1 辣蓼醇提液对HepG2.2.15 细胞分泌 HBsAg、HBeAg的影响

注：与细胞对照组比较,*P<0.05,**P<0.01。

3 讨论

现代药理实验表明，蓼属的植物体外对多种致病菌起到良好的抗菌作用，能对肝癌BEL-7404细胞株有杀伤作用，还能抑制乙型肝炎病毒DNA多聚酶、降解HBV-DNA[2,3]。然而，目前对其尚缺乏系统性和深入的药理学方面的研究，不利于辣蓼的开发利用。本实验结合现代研究技术和方法对辣蓼在抗乙肝病毒，保护肝脏等方面的运用提供了科学的阐释。实验结果显示，辣蓼醇提液对 HepG2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg 均有明显抑制作用，呈一定的量效关系；但同时也具有一定的毒性，用药时须注意剂量的控制。

[1]国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草·第2卷.[M].上海:上海科学技术出版社，1999:666.

[2]Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival : application to proliferation and cytotoxicity assays[J]. J Immunol Methods, 1983, 65(122):55263.

[3]胡海滨.“耐药菌株”中草药筛选试验的研究[J].广东医药学院学报,1990,6(1):40.

EffectOfPolygonumPerfoliatumL.OnTheExpressionOfHBsAgAndHBeAgInHepG2.2.15Cells

LI Ming1LI Xiao-fu2ZHANG Ke-feng2

1.Guilin Traditional Chinese Medical Hospital, Guangxi Province, Guilin 541002, China;2.Guilin Medical University，Guangxi Province,Guilin 541004,China

ObjectiveTo research the effect ofPolygonumPerfoliatumL. on the expression of HBsAg and HBeAg in HepG2.2.15 cells.MethodsThe cytotoxicity ofPolygonumPerfoliatumL. was detected by MTT colorimetric assay.Diffrenent concentrations ofPolygonumPerfoliatumL. acting on HepG2.2.15 cells for 72h, and HBsAg, HBeAg in the cells was detected by ELISA.ResultsThe alcohol extract ofPolygonumPerfoliatumL.(1.8 and 0.9mg/ml)has significant toxicity for cells. The alcohol extract ofPolygonumPerfoliatumL.( 0.6、0.3 and 0.1mg/ml) shows inhibit effect to HBsAg、HBeAg(P<0.05), and has dose-effect relationship.ConclusionAlcohol extract ofPolygonumPerfoliatumL. shows the anti-HBV effect in Vitro, but also toxic to HepG2.2.15 cells.

PolygonumPerfoliatumL.；HepG2.2.15；HBsAg；HBeAg

李明，男，药理学硕士。

张可锋，E-mail:xueshengcailiao@163.com。

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1007-8517(2014)13-0002-02

2014.04.26)