6株大型真菌发酵提取物的抑菌及细胞毒活性研究

1.广东省微生物研究所，省部共建华南应用微生物国家重点实验室，广东省菌种保藏与应用重点实验室，广东省微生物应用新技术公共实验室，广东 广州 510070；2.大理学院农学与生物科学学院，云南 大理 671003

6株大型真菌发酵提取物的抑菌及细胞毒活性研究

陈玉婵1吕华明2谭国慧1李浩华1李赛妮1章卫民1

1.广东省微生物研究所，省部共建华南应用微生物国家重点实验室，广东省菌种保藏与应用重点实验室，广东省微生物应用新技术公共实验室，广东 广州 510070；2.大理学院农学与生物科学学院，云南 大理 671003

目的对6株广东大型真菌红汁乳菇(Lactarius hatsudake)G027、鸟巢菌(Cyathus sp.)G026、革耳菌(Panus sp.)G028、光亮小红孔菌(Pycnoporellus fulgens)G033、菌核斗菇(Lentinus tuber-regium)G025和有柄灵芝(Ganoderma gibbosum)G036的发酵提取物进行抑菌和细胞毒活性研究。方法分别采用滤纸片扩散法和SRB法对这6株大型真菌的发酵提取物进行抑菌和细胞毒活性研究。结果菌株G027、G028、G026和G033对金黄色葡萄球菌具有显著的抑菌活性，其抑菌圈直径分别为25.00、18.23、14.96和14.30 mm；6株大型真菌对神经胶质瘤细胞SF-268、乳腺癌细胞MCF-7、大细胞肺癌细胞NCI-H460和人肝癌细胞HepG-2均有不同程度的抑制作用，其中菌株G027的活性最为显著，对这4种肿瘤细胞株的IC50值分别为2.84、6.44、11.88和2.96 μg/mL。结论6株大型真菌具有抑菌和(或)细胞毒活性，值得进一步深入研究。

大型真菌；发酵；提取物；抑菌；细胞毒

大型真菌是我国传统医药中的重要组成部分，真菌入药在我国已有2000多年的历史，史上第一部药物名著《神农本草经》记载了茯苓、灵芝、猪苓、雷丸等10多种真菌[1]。大型真菌属于“创造系数”特别高的生物，含有大量结构多样的次生代谢产物[2]，其代谢产物具有抗菌、抗肿瘤、抗炎、抗病毒、增强免疫活性、降血压、降胆固醇等多种活性，已成为新药开发的重要天然资源，得到世界各国的重视。广东地处于热带亚热带地区，野生大型真菌资源十分丰富，据初步统计，广东省已知的大型真菌有1185种，隶属于4纲20目56科240属，占中国野生大型真菌的30%左右[3,4]，但已研究的大型真菌资源极少，大量的大型真菌资源还有待研究和开发。据统计，仅广东南岭自然保护区中就有55种具有抗肿瘤作用的大型真菌，占已知种类的16.6%[5]；粤北地区至少有75种抗肿瘤大型真菌，占已知种类的11.9%[6]。为了发掘具有药用功能的野生大型真菌资源，作者在前期对广东大型真菌活性菌株的筛选基础上，采用滤纸片扩散法和SRB法对6株大型真菌的发酵提取物进行抑菌和细胞毒活性研究，为进一步开发利用大型真菌资源奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 6株大型真菌菌株是由野外采集的新鲜子实体经组织分离法分离纯化后获得。通过对菌株的ITS序列测定取得基因登录号，并通过Blast程序在GenBank上进行相似性序列检索分析，确定分离菌株的种类(表1)。以上供试菌株均保存于广东省微生物研究所。

1.1.2 供试肿瘤细胞株及指示菌株 供试肿瘤细胞株：神经胶质瘤细胞SF-268、乳腺癌细胞MCF-7、大细胞肺癌细胞NCI-H460、人肝癌细胞HepG-2；指示菌株：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)。以上所有肿瘤细胞株和指示菌株均保存于广东省微生物研究所。

表1 6株大型真菌的种名及其基因登录号

1.1.3 培养基 马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g， KH2PO43 g， MgSO41.5 g，维生素B 10 mg，蒸馏水1 L，pH值自然。LB培养基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，蒸馏水1 L，pH7.0。RMPI 1640完全培养基：RPMI 1640基础培养基1 L，胎牛血清0.1 L，双抗(10000 U/mL青霉素和10000 U/mL链霉素)0.01 L，混匀，4℃保存。

1.1.4 药品与试剂 RMPI 1640培养基、胎牛血清、双抗(10000U/mL青霉素+10000U/mL链霉素)均购自Gibco公司；磺酰罗丹明B(SRB)、二甲基亚砜(DMSO)、氨苄青霉素(Ampicillin，Ap)、卡那霉素(Kanamycin Monosulfate，Km)均购自Sigma公司；顺铂(Cisplatin)，齐鲁制药有限公司；其他试剂为国产分析纯。

1.1.5 主要仪器 2123-2二氧化碳培养箱，Shellab；DMI3000B倒置显微镜，Leica；MULTISKAN GO全波长酶标仪，Thermo；RE-2000旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；LRH-250生化培养箱，上海一恒科技有限公司；THZ-C-1恒温培养振荡器，广州市正一科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株的液体发酵及其提取物的制备 取4℃保存的菌种转接到PDA斜面培养基上活化，挑取活化后的适量菌丝块接种于含250 mL马铃薯葡萄糖(PD)液体培养基的500 mL三角瓶中，27℃，120 r/min摇床培养7 d。发酵产物经过滤后收集发酵液，发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，于40℃减压浓缩至干，得到发酵液乙酸乙酯提取物，提取物再用DMSO配成浓度为50 mg/mL的待测样品。

1.2.2 抑菌活性的测定 采用滤纸片扩散法[7]测定待测样品的抑菌活性。将活化的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌用LB液体培养基配制成1×106～1×107cfu/ml的菌悬液，取200 uL制备好的菌悬液放入平板中，倒入温度为40～50℃的LB培养基，混匀，冷却，制成含菌平板。用无菌镊子夹取直径为6 mm的无菌滤纸片置于含菌平板上，每个平板放置3片，分别向每片滤纸片滴入5μL50mg/mL的样品，以5μLDMSO作空白对照，大肠杆菌以浓度为5μL200μg /mL 的硫酸卡那霉素作阳性对照，金黄色葡萄球菌以5μL 200 μg /mL 氨苄青霉素作阳性对照，每个样品设3个重复，37℃培养24 h后，观察细菌的生长情况和抑菌圈的大小，用十字测量法测量抑菌圈的直径，计算抑菌圈的直径(含滤纸片直径)。

1.2.3 细胞毒活性的测定 采用SRB[8]法测定样品对肿瘤细胞株生长的抑制活性。取对数生长期的SF-268、MCF-7、NCI-H460、HepG-2细胞，用胰酶消化，台盼蓝染色计数，台盼蓝排斥实验检测细胞活力大于95%后，用RMPI 1640完全培养基调整细胞浓度为3×104个/mL，细胞接种于96孔板，每孔加入180μL的细胞悬液，并设3个空白孔调零，于37℃、5%CO2培养箱培养24 h。待细胞贴壁后，每孔加入20μL待测样品，阴性对照加20μL培养基，以顺铂作阳性对照。置CO2培养箱中培养72 h后，加入50 μL 50%冷三氯醋酸固定细胞，4℃放置1 h后用蒸馏水洗涤5次，空气中自然干燥。然后加入4 mg/mL SRB溶液100μL/孔，室温中染色30 min，去上清，用1%冰醋酸洗涤5次。最后加入10 mmol/mL的Tris溶液200μL/孔，用酶标仪测定570 nm处的吸光值(A)，用以下公式计算样品对细胞生长的抑制率：

细胞生长抑制率(%) = (1-A样品组/A对照组)×100%。

IC50值通过SigmaPlot 10.0软件采用非线性曲线拟合的方法计算获得，所有数据均通过三次独立的实验获得，实验结果以平均值±标准差(Mean±SD)表示。

2 结果

2.1 发酵提取物的抑菌活性 采用滤纸片扩散法对6株大型真菌发酵液的乙酸乙酯提取物进行抗菌活性测试，结果显示菌株红汁乳菇G027的发酵提取物具有显著的抑菌活性，对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌圈直径分别为25.00 mm和10.93 mm。革耳菌G028、鸟巢菌G026和光亮小红孔菌G033的发酵提取物对金黄色葡萄球菌也有明显的抑制作用，其抑菌圈直径分别为18.23 mm、14.96 mm和14.30 mm(表2，图1)。

2.2 发酵提取物的细胞毒活性 采用SRB法测试了6株大型真菌发酵液的乙酸乙酯提取物对4种肿瘤细胞株的细胞毒活性，结果发现6株大型真菌的发酵提取物对4种肿瘤细胞株均有不同程度的抑制作用，其中红汁乳菇G027发酵提取物的细胞毒活性最为显著，对SF-268、MCF-7、NCI-H460、HepG-2细胞株的IC50值分别为2.02 μg/mL、1.53 μg/mL、2.35 μg/mL、1.87 μg/mL，与阳性对照药对细胞株SF-268和NCI-H460的IC50值相当，比阳性对照药对细胞株MCF-7和HepG-2的IC50值还要低，说明该菌株的提取物具有很强的细胞毒活性。鸟巢菌G026对这4种肿瘤细胞株也有明显的细胞毒活性，其IC50值分别为2.84 μg/mL、6.44 μg/mL、11.88 μg/mL、2.96 μg/mL，其它4株大型真菌的发酵提取物也具有一定的细胞毒活性，对肿瘤细胞MCF-7的IC50值在9.49～16.04 μg/mL之间。

表2 6株大型真菌发酵提取物的抑菌活性

注：“-”表示未测定抑菌活性。

a：红汁乳菇G027；b：革耳菌G028；c：黑蛋巢菌G026；d：光亮小红孔菌G033a: Lactarius hatsudake G027; b: Panus sp. G028; c: Cyathus sp. G026; d: Pycnoporellus fulgens G033

表3 6株大型真菌发酵提取物的细胞毒活性±s, n=3)

3 讨论

红汁乳菇是一种美味的食用菌，富含维生素、氨基酸、蛋白质、纤维素，具有高蛋白低脂肪的特点，长期食用具有一定的保健作用[9,10]。王军等[11]发现红汁乳菇子实体提取物具有抗菌活性。Gao等[12]和Zhang等[13]从红汁乳菇中分离的4个麦角甾醇衍生物中，发现ergosterol peroxide和一个新化合物5,8-epi-dioxy- (24S)-ergosta-6-en-3-ol对PLA2酶和HIV病毒有抑制作用。据记载，红汁乳菇还有抑制肿瘤的作用[14]。黑蛋巢菌属(Cyathus Hall.:Pers.)的部分种为药用真菌，如粪生黑蛋巢[C. stercoreus (Schw.) de Toni]与隆纹黑蛋巢[C. striatus (Hunds.: Pers.) Willd.]可用于治疗胃病[15]。Allbutt等[16]发现海莲娜黑蛋巢(C. helenae Brodie)能产生鸟巢菌素(Cyathin)的抑菌物质。革耳属(Panus Fr.)的有些种类也可以入药，如紫革耳[Panus conchatus (Bull.) Fr.]用于治疗腰酸腿疼，手足麻木，并具有抑肿瘤作用[15]。Lorenzen等[17]从革耳菌Panus sp.9096中分离出两个倍半萜naematolin和namatolon，有文献报道[18]namatolon可通过抑制胸腺嘧啶加入到DNA而抑制人食道癌细胞Eca-109的增殖。灵芝入药已有2000多年的历史，其药用功效丰富，具有免疫调节、抗肿瘤、降血糖、护肝、抗氧化、抗辐射等多种作用[19]。有柄灵芝民间用于治疗胃病[20]。菌核斗菇是热带地区的一种珍贵食用菌兼药用菌，其子实体与菌核皆能食用，已有文献报道其发酵产物具有抗菌活性[21]，其子实体具有抗肿瘤[22]作用。

本研究发现菌株红汁乳菇G027和黑蛋巢菌G026的发酵提取物具有显著的抑菌和细胞毒活性。目前对红汁乳菇的化学成分及其生物活性研究都基于其子实体，而未见对其菌株的发酵产物开展研究。由于红汁乳菇是外生菌根菌，尚不能人工栽培，野生资源稀少，因此，通过分离菌株的发酵产物研究活性成分是开发利用红汁乳菇的一条重要途径。革耳菌G028的发酵提取物也具有较好的细胞毒活性，而且对金黄色葡萄球菌具有明显的抑制作用；菌核斗菇G025的发酵产物对肿瘤细胞株MCF-7具有明显的细胞毒活性，但其抗菌活性并不明显，这可能与文献报道[21]的液体发酵条件和提取方法不同有关。此外，本研究还首次发现光亮小红孔菌G033对金黄色葡萄球菌和肿瘤细胞株MCF-7具有明显的抑制作用。因此，这6株大型真菌具有重要的研究价值，值得进一步对其活性代谢产物进行研究，有望从其发酵产物中分离出新型的抗菌或抗肿瘤活性化合物。

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Studyonantibacterialandcytotoxicactivitiesoffermentationextractsfromsixmacrofungalstrains

CHEN Yu-chan1, LV Hua-ming2, TAN Guo-hui1, LI Hao-hua1, LI Sai-ni1, ZHANG Wei-min1*

1.State Key Laboratory of Applied Microbiology, South China (The Ministry—Province Joint Development),Guangdong Provincial Key Laboratory of Microbial Culture Collection and Application; Guangdong Open Laboratory of Applied Microbiology;Guangdong Institute of Microbiology, Guangdong Province,Guangzhou 510070, China;2. College of Agriculture and Biology, Dali University,Yunnan Province, Dali 671003, China

Objective To investigate antibacterial and cytotoxic activities of fermentation extracts from six macrofungal strains of Guangdong province (Lactarius hatsudake G027, Cyathus sp. G026, Panus sp. G028, Pycnoporellus fulgens G033, Lentinus tuber-regium G025 and Ganoderma gibbosum G0?). Method Antibacterial and cytotoxic activities of fermentation extracts were examined by the filter paper dispersion method and the Sulforhodamine B (SRB) method, respectively. Results: Four strains (G027, G028, G026 and G033) showed significant anti-Staphylococcus aureus activity with inhibition zones of 25.00, 18.23, 14.96 and 14.30 mm respectively. The six strains displayed different degrees of cytotoxic activity against human tumor cell lines SF-268, MCF-7, NCI-H460 and HepG-2, among which the strain G027 exhibited the strongest cytotoxicity against the four tumor cell lines with IC50 values of 2.84, 6.44, 11.88 and 2.96 μg/mL, respectively. Conclusion The six macrofungal strains showed antibacterial and/or cytotoxic acitivities and deserved further study.

Macrofungus; fermentation; antibacterial; cytotoxic

广东省科技计划项目(2009B020201012)；广东省科学院青年科学研究基金项目(qnjj201009)。

陈玉婵，女，硕士，主要从事药用微生物代谢产物活性评价，E-mail：yuchan2006@126.com。

章卫民， E-mail：wmzhang58@qq.com。

R285.5

A

1007-8517(2014)09-0017-04

2014.03.05)