妇科千金片对大鼠慢性盆腔炎模型输卵管组织Caspase-3和Caspase-8表达的影响

,3 ,2,4* ,2

1.湖南中医药大学中药现代化研究重点实验室，湖南 长沙 410208;2.湖南中医药大学药学院，湖南 长沙 410208;3.湖南中医药大学中医诊断研究所，湖南 长沙 410007;4.国家中医药管局中药药性与药效实验室三级科研实验室，湖南 长沙 410208

妇科千金片对大鼠慢性盆腔炎模型输卵管组织Caspase-3和Caspase-8表达的影响

聂晶1李鑫1,3师振予1,2,4*郭建生1,2

1.湖南中医药大学中药现代化研究重点实验室，湖南 长沙 410208;2.湖南中医药大学药学院，湖南 长沙 410208;3.湖南中医药大学中医诊断研究所，湖南 长沙 410007;4.国家中医药管局中药药性与药效实验室三级科研实验室，湖南 长沙 410208

目的通过观察妇科千金片对SD大鼠慢性盆腔炎模型中输卵管组织Caspase-3蛋白和Caspase-8蛋白表达影响，深入探讨妇科千金片治疗慢性盆腔炎的作用机制。方法采用大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及解脲脲原体混合菌接种法，建立慢性盆腔炎模型，随机分成七组：空白组，模型组，假手术组，中药妇炎康(0.41g·kg-1)对照组，和妇科千金片低剂量组(0.52g·kg-1)、中剂量组(1.04g·kg-1)、高剂量组(2.08g·kg-1)。经药物治疗后，解剖大鼠取输卵管组织，运用免疫细胞化学法观察Caspase-3蛋白和Caspase-8蛋白表达情况。结果治疗21d后，与模型组比，妇科千金片低剂量组Caspase-3蛋白光密度值升高，具有明显差异(P<0.05)，妇科千金片中、高剂量Caspase-3蛋白光密度值明显升高，具有显著性差异(P<0.01)；与模型组比，妇科千金片低、中、高剂量Caspase-8蛋白光密度值明显升高，具有显著性差异(P<0.01)。结论妇科千金片可能通过升高Caspase-3蛋白和Caspase-8蛋白的表达，引发Caspase级联反应，促使炎性细胞凋亡，从而减轻输卵管组织炎性损害。

妇科千金片；慢性盆腔炎；半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-3；半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-8

盆腔炎(Pelvic Inflammatory Disease, PID)是指女性生殖器官以及其周围结缔组织、盆腔腹膜发生的炎症，临床上根据其危急程度和进展分为急性盆腔炎和慢性盆腔炎。慢性盆腔炎(Chronic Pelvic Inflammatory Disease，CPID)主要包括慢性输卵管炎与输卵管积水、输卵管卵巢炎及输卵管卵巢囊肿、慢性盆腔结缔组织炎[1]。因CPID反复发作，经久不愈，病情迁移，导致不孕不育、盆腔黏连性疾病等后果严重，其治疗是一个很棘手的问题。妇科千金片在临床中使用广泛，对急慢性盆腔炎、子宫内膜炎等妇科常见病具有显著疗效[2-3]。我们前期研究，发现妇科千金片对急性盆腔炎大鼠通过调节免疫球蛋白，提高机体免疫能力[4]，保护大鼠子宫、输卵管、卵巢等盆腔组织[5]，还可以通过调控基因转录环节，降低大鼠子宫、输卵管组织IL-6mRNA、NF-κB蛋白，发挥抗炎免疫作用[6-7]。本研究拟观察妇科千金片对大鼠慢性盆腔炎模型输卵管组织Caspase-3和Caspase-8蛋白表达影响，进一步验证妇科千金片在治疗慢性盆腔炎方面的疗效并探讨其作用机制。

1 实验材料

1.1 动物 雌性SD大鼠，SPF级，体质量(200±20)g，购自长沙斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SCXK(湘)2009-0004。

1.2 主要仪器 JY3002型电子天平；Shandon325型石蜡切片机；Motic B5显微摄像系统等。

1.3 药品及主要试剂 妇科千金片：株洲千金药业股份有限公司，批号20110901；妇炎康片：湖南湘泉制药有限公司，批号111105。Caspase-3免疫组化试剂盒，caspase-8免疫组化试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.4 菌株 大肠杆菌(Escherichia coli，菌种号26002)，金黄色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus，菌种号44152)，解脲脲原体(M.urealyticum，菌种号52011)，由湖南中医药大学免疫与微生物教研室伍参荣教授惠赠。

2 实验方法

2.1 慢性盆腔炎模型制备 参考文献方法[8-9]，用注射器分别抽取等体积的浓度为1×109CFU的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和解脲脲原体菌液，注入无菌培养皿中，混合均匀。将医用明胶片剪成大小0.5cm×0.5cm的方块，置于混合菌液中，使其充分接触。明胶充分饱和后，左手持鼠尾，将大鼠倒立，右手夹含混合菌液的明胶块经阴道塞至宫腔内，左右各1块，并保持大鼠倒立1～2min。隔天1次，连续4次。假手术组塞入不含菌液的明胶块。

2.2 动物分组及给药 将成功建立的模型组大鼠按体质量随机分为7组，每组10只。妇科千金片组高、中、低剂量分别按2.08，1.04和0.52 g·kg-1ig给予相应浓度的药液，妇炎康组按0.41g·kg-1给予妇炎康药液，空白对照组、假手术组及模型组分别给予等容积蒸馏水，ig给药，1次·d-1，连续21d。

2.3 大鼠慢性盆腔炎模型输卵管组织中Caspase-3和Caspase-8表达情况测定 解剖大鼠，取大鼠输卵管组织，用体积分数10%中性甲醛固定，常规石蜡包埋、切片。利用免疫组织化学法检测输卵管组织Caspase-3和Caspase-8表达情况。

2.4 统计学分析 采用SPSS17.0软件进行数据统计，数据均以表示，进行方差齐性检验，呈正态分布，采用单因素方差分析；呈非正态分布，则采用秩和检验。(P<0.05具有统计学意义，P<0.01具有显著统计学意义)。

3 结果

妇科千金片对大鼠慢性盆腔炎模型输卵管组织Caspase-3和Caspase-8表达情况与空白组比较，模型组大鼠输卵管组织Caspase-3蛋白表达有显著性差异(P<0.01)。经妇科千金片治疗后，与模型组相比，妇科千金片低剂量Caspase-3蛋白有显著性升高(P<0.05)，妇科千金片中、高剂量组Caspase-3蛋白的表达也有显著性升高(P<0.01)。

与空白组比较，模型组大鼠输卵管组织Caspase-8蛋白表达有显著性差异(P<0.01)。经妇科千金片治疗后，与模型组相比，妇科千金片低、中、高剂量组Caspase-8蛋白的表达有显著性升高(P<0.01)。见表1。

表1 妇科千金片对caspase-3蛋白和caspase-8蛋白光密度的影响

注：与空白组相比▲P<0.05,▲▲P<0.01；与模型组相比★P<0.05,★★P<0.01

4 讨论

近年来研究发现，在组织损伤过程中巨噬细胞识别吞噬中性粒细胞，避免炎症反应发生，半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶(cysteinyl aspartate specific protease，caspase)在其细胞凋亡过程中有重要意义。其中Caspase-3、8蛋白的表达有促进凋亡作用，Caspase-3、8蛋白触发炎症细胞凋亡是促进炎症恢复的机制之一。李华等[10]发现，手术组大鼠脊髓全横断损伤后脊髓灰质白质均检测到凋亡细胞，Caspase-3在损伤周围组织呈阳性，同时对比手术组Caspase-3表达显著高于假术组。在慢性炎症由发生、发展过程中T细胞的活化发挥重要作用，而Caspase-8是T细胞的活化中重要因子。T细胞活化过程中检测到多种Caspases活性。Alam[11]用抗CD3抗体刺激人外周血单核细胞，发现Caspase-8被活化，同时还检测到其下游的Caspase-3的活性。在本研究中，在空白组输卵管组织中Caspase-3、8蛋白的光密度最低，提示Caspase-3、8蛋白在正常组织中含量较少。慢性盆腔炎模型组织中Caspase-3、8蛋白的光密度值明显高于空白组，具有高度统计学意义(P<0.01)，证明Caspase-3、-8蛋白在炎症反应中其表达上调，与文献报道一致[12]。妇科千金片治疗后，与模型组比，妇科千金片低、中、高剂量组Caspase-3、Caspase-8蛋白光密度值明显升高，具有高度统计学意义(P<0.01)，证明妇科千金片可以促进Caspase-3、Caspase-8蛋白的表达。慢性炎症由活化的T细胞介导，提示在慢性盆腔炎模型中，妇科千金片可能通过活化T细胞，TNF与TNFR-1结合，下传凋亡信号，进而激活Caspase-8再活化Caspase-3,引起Caspases级联反应。通过此途径激发炎性细胞凋亡，使慢性炎症吸收消散，减轻输卵管组织炎性损伤，促进输卵管炎症恢复。

[1]乐杰．妇产科学[M]．5版．北京：人民卫生出版社，2002，295-303．

[2]张宇虹.妇科千金胶囊在慢性盆腔炎合并卵巢囊肿中的应用[J].中医中药，2012，50(21)：75-76.

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TheinfluenceofFukeQianjinTabletstorat’sCaspase-3andCaspase-8expressionofthefallopiantubeswithchronicpelvicinflammatorydisease

NIE Jing1，LI Xin1,3，SHI Zhenyu1,2,4*， GUO Jiansheng1,2

1. Key Laboratory of Modernization of Chinese Medicine，Hunan University of Chinese Medicine , Chang sha 410208 ,China；2.Shools of Pharmacy, Hunan University of Chinese Medicine , Chang sha 410208 ,China；3. Institute of Traditional Chinese Medicine, Hunan University of Chinese Medicine, Chang sha 410007, China

Objective To study the influence of FukeQianjin Tablets to rat’s Caspase-3 、Caspase-8 expression of the fallopian tubes with chronic pelvic inflammatory disease. Method The rats were established by mixed bacteria of Escherichia coli ,Staphyloccocusaureus and M.urealyticum. The rats were randomly divided into 7 groups :the control group, the model group，the low dosage group, the middle dosage group and the high dosage group of FukeQianjin Tablets, Fuyankang group. FukeQianjin Tablets in high, middle and low dosage were used to treat chronic pelvic inflammation model rat for 21days. Takes rat’s the fallopian tubes , the expression of caspases-3 and caspases-8 was detected by immunocytochemistry. Results After 21 days, Compared with model group, the expression of caspases-3: the FukeQianjin Tablets in low dosage groups were higher than in model group(P<0.05)，the FukeQianjin Tablets in middle and high dosage groups were markedly higher than in model group(P<0.01); the expression of caspases-8 :the FukeQianjin Tablets groups were markedly higher than in model groups(P<0.01)Conclusion FukeQianjin Tablets may improve the expression of caspases-3、caspases-8, produce Caspase cascade, make inflammatory cells to apoptosis, relieve ovarian tissue inflammatory pathological damage eventually.

FukeQianjin Tablets;； chronic pelvic inflammatory disease； caspase-3 ；caspase-8

湖南省高校创新平台开放基金(10K045)。

聂晶，女，硕士，E-Mail:niejing2007521@sina.com。

师振予，女，博士，讲师，E-mail:helenszy@hotmail.com。

R285.6

A

1007-8517(2014)09-0008-03

2014.03.09)