燕麦microRNAs及其靶基因的生物信息学预测

郭红媛，贾举庆，段 娜，张怡晴，舒国平，陈潇洒

（山西农业大学农学院，山西太谷030801）

microRNAs（miRNA）是在真核生物中发现的一类内源性且具有调控功能的非编码单链RNA，大小约为22个核苷酸。其主要参与发育、病毒防御、信号转导等多种调控[1-3]。成熟miRNA识别靶基因位点后，可与靶基因位点紧密结合，破坏或阻遏蛋白质翻译机制。由于序列微小，因此，一般极难检测。现在已发现大量的miRNAs，新的miRNAs也正陆续被发现。miRNA通常可以控制多个靶位点，它们可以与多达1 000种甚至更多不同的靶位点结合，有时基因也可能受到多个miRNA调控，因此，难以了解其复杂的相互作用。

目前，研究miRNA表达量和表达位点可采用分子生物学和生物信息学等方法。其中，分子生物学法可以特异性地鉴定miRNAs，但依赖于极强的技术能力，且耗时耗力，成本高[4]。随着新一代测序技术的发展，small RNA测序技术为发现miRNAs提供了强有力的手段。此外，根据miRNAs在植物物种中的高度保守性，利用比较基因组学和生物信息学方法可以从大量已测序的EST和GSS等数据库中挖掘、鉴定miRNAs，了解miRNA群或其结构信息并获取更多的细胞功能分析。

目前，利用生物信息学方法已在玉米、小麦、高粱等植物中有效地预测到大量的miRNA[5-8]。燕麦是一种粮、经、饲、药兼用的世界分布型植物，因其营养价值高而且具有抗病、耐瘠、抗旱等优良性状而引起了众多研究者的关注[9-11]，公共数据库中也积累了大量的EST和GSS序列，这为研究燕麦提供了很好的可利用资源。目前，对燕麦miRNA的鉴定以及对靶基因调控方面的研究尚未见报道。

本研究根据miRNA序列的保守性，用大麦、小麦、二穗短柄草等植物miRNAs序列在燕麦EST数据库和GSS数据库中进行检索和筛选，预测得到燕麦miRNA及其靶基因，补充了燕麦miRNA数据，并为燕麦miRNA对抗旱性调控等研究方面奠定了一定的基础。

1 材料和方法

1.1 序列来源

根据序列在进化方面的保守性，采用同源性搜索方法，从miRNA数据库miRBase（http://www.mirbase.org/index.shtml）下载已登记的1 910条miRNA序列。在美国国家生物技术信息中心（NCBI）收录的燕麦EST数据库和概览序列（GSS）数据库中，将1 910条miRNA序列去重复后用来检索潜在的燕麦miRNA序列。

1.2 序列检索方法

从miRNA数据库中下载已有植物miRNA序列，用多序列比对软件ClustalW2（http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/）比对后去除重复序列；用这些序列进行BLAST（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）在线比对，检索NCBI中的燕麦EST和GSS数据库，将少于4个碱基错配的同源序列作为重复序列去除；再与NCBI数据库中进行BLASTX比对，去除燕麦蛋白质编码序列后，将剩余序列作为燕麦候选miRNA序列。

1.3 miRNA二级结构及靶基因的预测

将所得序列用Mfold 3.2软件（http://mfold.rit.albany.edu/?q＝mfold/RNA-Folding-Form）预测其二级结构，根据对miRNA的筛选标准[12-13]进行预测、鉴定。用psRNATarget（http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/）对符合miRNA二级结构标准的序列进行靶基因预测。

2 结果与分析

2.1 燕麦miRNAs的预测

从 miRBase下载山羊草（2）、二穗短柄草（464）、油棕（6）、高羊茅（15）、大麦（69）、水稻（713）、高粱（241）、甘蔗（36）、小麦（43）和玉米（321）已登记的miRNA序列，截至2013年10月共1 910条。对其进行多序列比对后，将重复序列只保留1条。用留下来的序列检索NCBI中的燕麦EST和GSS数据库，检索到的序列经多序列比对，重复序列保留1条。然后，将留下来的序列在燕麦的蛋白质数据库中进行BLASTX比对（以去除其中编码序列），结果共获得143条非编码的候选燕麦miRNA序列，对143条pre-miRNA的统计分析得到的参数（前体序列长度L＞60 nt；GC含量为30%＜CG＜71%；二级结构生成自由能△G＜-41.18 kJ/mol）进行进一步筛选，若符合所有条件的片段则作为候选，不符合这些条件的片段则弃之。之后，对候选序列用Mfold

3.2 进行二级结构预测并分析。

根据预测miRNA二级结构的标准，miRNA前体结构中具有茎环结构，且成熟的miRNA尽量位于茎环结构的臂上；miRNA与互补链间错配应少于5个碱基；miRNA互补链上不能有大的突起或缺口；以最小折叠自由能系数（MFEI）大于8.5来判断所预测的序列是否为符合二级结构的miRNA序列（图1）。

经分析、筛选，共有46条序列符合miRNA鉴定标准，表1列出了其中的10条。

2.2 燕麦miRNA靶基因的预测

经psRNATarget在线预测所得的46条符合鉴定标准的燕麦miRNA序列的靶基因，预测时选择期望值为3.0，允许不配对的最大能量（UPE）小于25.0，其余参数为默认值。结果共找到61个靶基因，部分序列的功能信息列于表2。

表1 预测到的燕麦miRNAs

表2 预测到的燕麦miRNA靶基因

3 讨论

本研究预测的燕麦miRNAs序列，首先其前体序列必须具有重要特征——发卡结构，而且预测的成熟miRNA序列要尽量位于其前体序列二级结构的“臂”上，避免处于“环”结构中；如不能避免，其与“环”结构最多有4 nt配对。为与其他类型的RNAs进行区分，又采用了2个鉴定miRNA的重要参数，即最小折叠自由能（MFE）和最小折叠自由能系数（MFEI），研究发现，MFE与前体序列的长度和GC含量有关，燕麦miRNA前体的MFEI平均值为1.06，高于 mRNA（0.62～0.66），rRNA（0.59）和 tRNA（0.64）[14]，也高于前人的研究结论 0.85，结果证实，MFEI为预测miRNA的重要且可靠参数。

在预测到的靶基因中，绝大多数是编码与生长发育有关的蛋白质，参与新陈代谢，编码转录因子调控生长、发育以及其他生理代谢过程，如膜蛋白相关的物质运输、细胞信号转导等。这些靶基因分别属于不同的基因家族，部分靶基因编码的蛋白功能未知。本研究预测的miRNAs前体序列中有的具有多个成熟的miRNA序列，前体序列长度为107～315 nt。预测的成熟miRNAs的位置有的位于3'端，有的位于5'端。所预测的所有miRNA前体序列在长度和二级结构方面虽各不相同，但都分别可折叠成标准的miRNA二级结构。在预测的燕麦miRNA序列中大多是编码与生长发育相关的蛋白质，可能参与燕麦生长中的新陈代谢活动，有一些是与信号传导相关的，还有一些可能是编码转录因子的。但由于目前燕麦基因组信息在网上公布信息的不完全，本研究对部分预测的miRNA序列仍未能预测到其功能。目前，有许多软件可对RNA功能进行预测，如：TargetScan（http://www.targetscan.org/），PicTar（http://pictar.mdc-berlin.de/），MiRscan（http://genes.mit.edu/mirscan/）等。想要得到准确的预测结果，可以用多种软件反复预测、比较，但预测结果最终需经实验进一步验证。

miRNAs作为一种非编码的基因表达调控因子，虽已有在小麦、水稻、玉米、棉花、花生、烟草等[15-17]方面的研究，但目前对燕麦miRNAs生物学功能及调控机理的研究还不多。本研究预测了燕麦miRNAs序列及其靶基因，为进一步研究燕麦miRNAs的功能奠定了基础（可为开展具体的实验验证提供依据，从而对燕麦miRNAs生物学功能注释缩小范围）。相信随着生物信息学的发展，会有更多、更全面的基因组序列公布于网上，会发现更多的燕麦miRNAs。

［1］段成国，王春晗，郭惠珊.MicroRNA对植物生长发育和病毒侵染的调控[J].科学通报，2006，51（4）：371-375.

［2］郭晓琴，孙红正.microRNA靶基因检测技术研究进展[J].河南农业科学，2013，42（4）：11-13.

［3］耿锐梅，杨宏伟，曹长代，等.植物MicroRNA研究进展及其在植物与病原菌互作中的作用 [J].浙江农业科学，2011（5）：1092-1094.

［4］苏小茜，张清政，姜枫，等.MicroRNA研究方法进展[J].上海畜牧兽医通讯，2008（5）：2-4.

［5］李婧，熊莉丽，胡久梅，等.基于EST和GSS序列的玉米未知微RNA的数据挖掘[J].生物技术通报，2011（12）：108-112.

［6］韩友生，栾福磊，朱洪亮，等.生物信息学方法挖掘小麦microRNAs及其靶基因[J].中国科学，2009，39（6）：585-595.

［7］杜江峰，武永军，方晓峰，等.生物信息方法预测高粱miRNA及其靶基因[J].科学通报，2010，55（7）：553-561.

［8］蔡斌，李成慧，彭日荷，等.葡萄microRNA的计算识别[J].华北农学报，2008，23（S2）：213-216.

［9］周建萍，刘龙龙，崔林.山西省燕麦育种现状及资源特点[J].山西农业科学，2010，38（11）：6-9.

［10］刘龙龙，崔林，刘根科，等.山西省燕麦产业现状及技术发展需求[J].山西农业科学，2010，38（8）：3-5.

［11］刘龙龙，崔林，周建萍，等.利用核不育燕麦新种质选育新品种品燕 2号[J].山西农业科学，2012，40（5）：445-446.

［12］Zuker M.Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction[J].Nucleic Acids Res，2003，31（13）：3406-3415.

［13］张磊，曹江涛，崔萌萌.茄子microRNAs与其靶基因的生物信息学预测[J].遗传，2011，33（7）：776-784.

［14］Zhang B H，Pan X P，Cox B，et al.Evidence that miRNAs are different from other RNAs[J].Cell Mol Life Sci，2006，63（2）：246-254.

［15］潘玉欣，刘恒蔚.花生miRNA与其靶基因的生物信息学预测[J].中国油粮作物学报，2010，32（2）：290-294.

［16］金伟波，李楠楠，吴方丽，等.水稻MicroRNA的预测及实验验证[J].中国生物化学与分子生物学报，2007，23（9）：743-750.

［17］Frazier TP，Xie FL，Freistaedter A，et al.Identification and characterization of microRNAsand their target genesin bobacco（Nicotiana tabacum）[J].Planta，2010，232（6）：1289-1308.