核转录因子CDX2抑制胃癌细胞迁移、侵袭与逆转上皮-间质转化有关

钱雪芬 张健锋 俞智华 鞠少卿 毛振彪#

南通大学附属医院消化内科1(226000) 外科综合实验室2

胃癌是一种严重危害人类健康的常见恶性肿瘤，在全球男女性癌症死因中分居第三和第五位，研究胃癌的发生、发展过程，提高胃癌患者的早期诊断率和生存率已成为目前临床研究工作的重点。上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是上皮细胞失去上皮特征、同时获得间质特征的过程，这一过程与上皮性恶性肿瘤的侵袭、转移密切相关[1-4]。尾型同源盒转录因子2(caudal-type homeobox transcription factor 2, CDX2)是一种肠特异性核转录因子，在维持正常肠上皮细胞分化和增殖调控中起重要作用。研究[5-7]发现CDX2过表达能抑制胃癌细胞生长增殖，诱导细胞凋亡，并降低其迁移、侵袭能力，提示CDX2基因在胃癌中起抑癌基因作用。CDX2抑制胃癌的作用是否与影响EMT有关，目前尚不清楚。本研究旨在探讨CDX2对胃癌细胞迁移、侵袭能力的影响与EMT的关系，为揭示胃癌侵袭、转移的分子机制提供实验依据。

材料与方法

一、细胞株和主要试剂

人胃癌细胞株SGC-7901、MKN-45、AGS购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。pGPU6/GFP/Neo-CDX2-shRNA质粒和无关序列(阴性对照)shRNA质粒由上海吉玛制药技术有限公司构建，pEGFP-N1-CDX2真核表达质粒和空质粒由南通大学附属医院外科综合实验室提供。Lipofect-amine®2000 转染试剂、TRIzol®试剂、RevertAid第一链cDNA合成试剂盒(Thermo Fisher Scientific Inc.)，FastStart Universal SYBR Green Master(Rox)(Roche Applied Science)，Transwell小室(EMD Millipore)，兔抗人上皮细胞钙黏蛋白(E-cadherin)和波形蛋白(vimentin)多克隆抗体(Proteintech Group, Inc.)。

二、方法

1. 细胞培养：3株人胃癌细胞使用含10% FBS和100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的DMEM培养基，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，0.25%胰蛋白酶消化传代。

2. 质粒转染：转染前24 h于6孔板中每孔接种5×105个细胞，加入2 mL无抗完全培养基，细胞汇合度达到70%～80%时，分别以250 μL无血清培养基稀释4.0 μg质粒DNA和10 μL Lipofectamine®2000转染试剂，室温静置5 min。混合两种稀释液，室温静置20～30 min，加入至6孔板中，补充无血清培养基至每孔2 mL，37 ℃、5% CO2培养箱中培养。转染后4～6 h更换无抗完全培养基继续培养。

3. 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)：取对数生长期细胞或各组转染后48 h细胞，以TRIzol®试剂提取总RNA，以RevertAid第一链cDNA合成试剂盒逆转录合成cDNA，反应条件：42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min，逆转录产物-20 ℃保存，待行qRT-PCR。Primer Primier 5.0软件设计CDX2和内参照β-actin的qRT-PCR引物。CDX2引物序列：F 5’-CGC CGC AGA ACT TCG TCA G-3’，R 5’-CGT AGC CAT TCC AGT CCT CCC-3’；β-actin引物序列：F 5’-TGA CGT GGA CAT CCG CAA AG-3’，R 5’-CTG GAA GGT GGA CAG CGA GG-3’。qRT-PCR反应体系内含FastStart Universal SYBR Green Master(Rox)10 μL、cDNA 3 μL、上、下游引物各0.6 μL(10 μmol/L)，以RNase-free H2O补足至20 μL。反应条件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40个循环。2-△△Ct法计算CDX2 mRNA相对表达量。

4.划痕试验：取各组转染后24 h细胞，于6孔板中每孔接种5×105个，无抗完全培养基培养24 h后，以无菌200 μL枪头在单细胞层上划痕，PBS洗去脱壁细胞，加入无血清培养基继续培养。于划痕后不同时间点在倒置显微镜下每孔选取4个视野拍照，记录划痕修复情况。划痕修复率=(0 h划痕宽度-某时点划痕宽度)/0 h划痕宽度。

5. 细胞侵袭实验：于Transwell小室上室面涂布30 μL Matrigel基底膜基质胶，37 ℃放置1 h。取各组转染后48 h细胞，无血清培养基重悬，以1×105/孔接种于Transwell小室上室中(100 μL)，下室中加入含20% FBS的培养基600 μL，37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h。取出小室，PBS清洗，以棉签轻轻拭去上室滤膜内侧面贴壁细胞， 4%多聚甲醛溶液固定滤膜10 min，结晶紫染色15 min，PBS清洗，待上室自然风干，光学显微镜下计数滤膜背面侵袭细胞，每张滤膜随机计数中央部分和周围部分共10个低倍视野(×100)，结果取均值。

6. 蛋白质印迹法：取各组转染后48 h细胞提取总蛋白，测定蛋白含量，-80 ℃保存。SDS-PAGE凝胶电泳：上样，恒压调节80 V 30 min后120 V电泳60 min，恒流转膜至PVDF膜300 mA 120 min，5%脱脂牛奶室温摇床封闭2 h，将经封闭液稀释的一抗(兔抗人E-cadherin、vimentin多克隆抗体)稀释液平铺在封闭后的PVDF膜上，4 ℃孵育过夜，洗膜，加入HRP标记的二抗，室温孵育2 h，洗膜，ECL显影，图像处理系统分析目的条带，计算目的蛋白相对表达量。

三、统计学分析

结 果

一、胃癌细胞CDX2 mRNA表达

qRT-PCR检测显示，AGS细胞中CDX2 mRNA高表达，SGC-7901和MKN-45细胞中CDX2 mRNA低表达，相对表达量分别为365.369±78.160、1.000±0.143和7.713±1.517(AGS对SGC-7901和MKN-45，P均<0.05)。

二、质粒转染效率

予CDX2低表达的MKN-45细胞转染CDX2真核表达质粒或空质粒，予CDX2高表达的AGS细胞转染CDX2-shRNA或阴性对照shRNA，转染后48 h以qRT-PCR检测CDX2 mRNA表达以评估转染效率。结果显示，与未转染或转染空质粒相比，MKN-45细胞转染CDX2过表达质粒pEGFP-N1-CDX2后，细胞中的CDX2 mRNA相对表达量显著增高(3 064.000±278.160对1.000±0.143和7.253±1.517，P均<0.05)；与未转染或转染阴性对照shRNA相比，AGS细胞转染CDX2干扰质粒pGPU6/GFP/Neo-CDX2-shRNA后，细胞中的CDX2 mRNA相对表达量显著降低(1.000±0.240对11.567±1.460 和12.579±0.980，P均<0.05)。

三、胃癌细胞迁移能力

划痕试验显示，与同时点未转染或转染空质粒相比，过表达CDX2的MKN-45细胞48 h和72 h时划痕修复率明显降低，组间差异有统计学意义，表明细胞迁移能力降低；与同时点未转染或转染阴性对照shRNA相比，沉默CDX2表达的AGS细胞12 h、24 h和36 h时划痕修复率均明显增高，组间差异有统计学意义，表明细胞迁移能力增强。转染空质粒的MKN-45细胞和转染阴性对照shRNA的AGS细胞与相应未转染细胞相比，各时点划痕修复率均无明显差异(图1)。

四、胃癌细胞侵袭能力

细胞侵袭实验显示，与未转染或转染空质粒相比，过表达CDX2的MKN-45细胞穿膜细胞数显著减少，表明细胞侵袭能力降低；与未转染或转染阴性对照shRNA相比，沉默CDX2表达的AGS细胞穿膜细胞数显著增多， 表明细胞侵袭能力增强。转染空质粒的MKN-45细胞和转染阴性对照shRNA的AGS细胞与相应未转染细胞相比，穿膜细胞数均无明显差异(图2)。

EV：空质粒(empty vector)；NC：阴性对照(negative control)

五、胃癌细胞EMT标记物表达

蛋白质印迹法检测显示，与转染空质粒相比，过表达CDX2的MKN-45细胞中上皮标记物E-cadherin表达显著增高，间质标记物vimentin表达显著降低，表明胃癌细胞发生EMT逆转；与转染阴性对照shRNA相比，沉默CDX2表达的AGS细胞中E-cadherin表达显著降低，vimentin表达显著增高，表明胃癌细胞发生EMT(图3)。

讨 论

EMT是上皮细胞在特定条件下失去极性，向间质细胞转化的现象，是多细胞生物胚胎发育中的一个基本过程[3-4]，可使在特定部位产生的上皮细胞从上皮组织中分离并迁移至其他位置，是正常发育、伤口愈合、组织重建等的基础。目前，大量研究证实EMT参与了恶性肿瘤的发生、 发展， 是肿瘤侵袭、转移的一个重要过程[1-4]，EMT概念的提出使人们对肿瘤侵袭、转移的发生机制有了更深刻的理解。EMT发生过程复杂，包括细胞间黏附力丧失、细胞外基质破坏、细胞骨架重建等，涉及多个信号途径和多种分子机制。在EMT过程中，上皮标记物E-cadherin等表达降低，而间质标记物vimentin、fibronectin等表达增高，因此本研究选择检测E-cadherin、vimentin表达水平以反映胃癌细胞的EMT状态。

A、B：各组穿膜细胞(×100)；C、D：各组每低倍视野穿膜细胞数比较(*P<0.05)

A：各组EMT标记物表达蛋白质印迹法电泳图；B：各组EMT标记物相对表达量比较(*P<0.05)

核转录因子CDX2在肠道发育和分化过程中起关键作用。研究发现CDX2在结肠癌中发挥抑癌基因功能，其表达下调或缺失可导致染色体不稳定，在结肠肿瘤发生中起关键作用：结肠癌组织CDX2表达较临近正常组织显著降低；杂合子Apc+/Delta716腺瘤性息肉病小鼠如合并CDX2+/-，结肠息肉数量可增加约6倍[8]；经致癌剂氧化偶氮甲烷处理的CDX2+/-小鼠发生远端结肠侵袭性腺癌，野生型小鼠则未见肿瘤发生，CDX2+/-小鼠结肠上皮对放疗诱导的细胞凋亡的敏感性亦低于野生型小鼠[9]。最近研究[10]证实，结肠癌细胞内受体酪氨酸激酶信号通路异常激活，诱导CDX2表达下调并促进EMT，导致结肠癌侵袭、转移。

CDX2是一种肠上皮细胞特异性核转录因子，正常胃黏膜组织不表达CDX2，而肠化生、异型增生和胃癌组织中存在CDX2异位表达[11]。近年研究显示CDX2在胃癌中亦发挥抑癌基因功能。体外实验和裸鼠原位移植瘤模型均证实过表达CDX2可明显抑制胃癌细胞生长增殖[5-7]，体外实验中，恢复胃癌细胞的CDX2表达还可降低其迁移、侵袭能力[5]。本研究划痕试验和细胞侵袭实验显示，予CDX2基因低表达的人胃癌细胞株MKN-45过表达CDX2能显著抑制其迁移、侵袭能力，而沉默CDX2基因高表达的人胃癌细胞株AGS中的CDX2表达后，其迁移、侵袭能力显著增强，表明CDX2表达水平改变可影响胃癌细胞的迁移、侵袭能力，从而参与胃癌的侵袭、转移过程。蛋白质印迹法检测显示，过表达CDX2可上调MKN-45细胞的E-cadherin表达，下调vimentin表达，而沉默CDX2表达的作用与之相反，由此推测CDX2可能参与了胃癌细胞EMT的调控，其表达缺失可促进EMT，过表达时则能逆转EMT，从而抑制胃癌细胞迁移、侵袭。但CDX2具体通过何种途径调控EMT，进而参与胃癌的发生、发展，目前尚无明确结论，其间的分子机制有待深入研究。CDX2与EMT关系的研究可能为胃癌的诊断、治疗提供新的诊断标记物和治疗靶点。

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