基于DPO引物的空肠弯曲菌PCR检测方法的建立与初步应用

徐义刚，李丹丹，刘忠梅，吴 岩，魏冬旭，李苏龙*

(1.黑龙江出入境检验检疫局检验检疫技术中心，黑龙江哈尔滨 150001；2.海南出入境检验检疫局检验检疫技术中心，海南海口 570125）

基于DPO引物的空肠弯曲菌PCR检测方法的建立与初步应用

徐义刚1，李丹丹2，刘忠梅1，吴 岩1，魏冬旭1，李苏龙1*

(1.黑龙江出入境检验检疫局检验检疫技术中心，黑龙江哈尔滨 150001；2.海南出入境检验检疫局检验检疫技术中心，海南海口 570125）

为建立特异、快速检测空肠弯曲菌的方法，本研究针对其gyrA基因设计了一对双启动寡核苷酸引物(DPO），建立了空肠弯曲菌DPO-PCR检测方法。试验结果显示，该方法的检测下限为1.2×102cfu/mL，在48℃～68℃退火温度范围内均可高效扩增靶基因片段，表明该方法退火温度范围宽，同时DPO引物特异性强，PCR反应过程中不会产生非特异性扩增。利用该方法对采集的184份样品进行检测，共计检出17份空肠弯曲菌阳性样品，经国标法(GB/T 4789.9-2008）复验，两者检测结果一致，显示了良好的实用性。该DPO-PCR方法设计简单、特异性强，为致病微生物的快速准确检测提供了新方法。

空肠弯曲菌；gyrA基因；DPO-PCR

空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni）是一种重要的人畜共患病致病菌，也是一种危害严重的食源性致病菌，引起人类细菌性腹泻的暴发流行或集体性食物中毒，严重时可引起周围神经自身免疫性疾病—格林 -巴利综合症(Guillain-barre syndrome）[1-2]。C.jejuni广泛存在于各种动物体内，尤以家禽、野禽和家畜带菌最多，并且多为无症状带菌，是重要的传染源和贮存宿主[3]，人类主要通过与带菌动物接触或食用被污染的食品而感染发病，患病者多为儿童[4-5]。鉴于C.jejuni的危害性，建立快速而特异的检测方法具有重要意义。

PCR方法灵敏度高，检测结果准确，被广泛应用于致病微生物的诊断[6]。双启动寡核苷酸引物(Dual-Priming Oligonucleotide,DPO）是一种新型的PCR引物设计方法[7-10]，具有退火温度范围宽、特异性强而设计简易的特点。设计DPO引物时，只需先确定其短3'端，长度为6 bp～15 bp，使其GC含量在40%～80%范围内，然后反向延伸18 bp～25 bp，使其Tm值大于65℃，形成引物的长5'端，中间用多聚次黄嘌呤肌苷(poly I）连接，无需对引物参数进行优化，有效地简化了PCR引物设计流程和试验步骤，更增强了检测特异性，为致病微生物的快速准确检测提供了新方法。本研究基于DPO引物建立了特异性检测C.jejuni的PCR方法。

1 材料和方法

1.1 细菌株及主要试剂 实验菌株空肠弯曲菌(ATCC 33560）、肠出血性大肠杆菌 O157∶H7(ATCC 35150）、大肠杆菌(ATCC 25922）、沙门氏菌(ATCC 10708）、单核细胞增生李斯特氏菌(ATCC 19111）、变形杆菌(ATCC 49027）、志贺氏菌(ATCC 12022）、金黄色葡萄球菌(ATCC 29213）、阪崎肠杆菌(ATCC 51329）、粘质沙雷菌(ATCC 14756）、小肠结肠炎耶尔森氏菌(ATCC 9610）、嗜水气单胞菌(ATCC 7966）、霍乱弧菌(ATCC 14035）、副溶血弧菌(ATCC 27519）、溶藻弧菌(ATCC 33839）和创伤弧菌(ATCC 33149）均购自美国典型菌种保藏中心(ATCC），溶血性链球菌(CMCC 32121）购自中国医学微生物菌种保藏中心(CMCC）；细菌基因组DNA提取试剂盒购自TIANGEN公司；TaqDNA聚合酶及相关试剂购自TaKaRa公司；增菌培养基BPW购自北京兰伯瑞生物技术公司；184份临床检测样品采自畜禽饲养场和市场流通食品，包括鲜奶及奶制品、鸡肉、禽粪便拭子以及污水等。

1.2 引物设计 以C.jejuni的gyrA基因为靶基因，选择其保守区域设计DPO引物(表1），引物由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 引物序列Table 1 Primers used in this study

1.3 细菌基因组D N A的提取 将各实验菌株分别接种于BPW培养基，按最佳生长条件进行增菌培养，提取各菌株基因组DNA用于特异性试验。临床样品的检测采用煮沸法提取细菌DNA。

1.4 DPO-PCR反应体系优化TaqDNA聚合酶(5 U/μL）用量范围 0.05 μL～0.5 μL，以 0.05 μL 递增；Mg2+(25 mM）用量范围 0.25 μL～2.5 μL，以0.25 μL 递增；dNTP(2.5 mM）用量范围 0.25 μL～2.5 μL，以 0.25 μL 递增，反应体系为 25 μL。扩增程序：95℃ 5 min；95℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃30 s，30个循环；72℃10 min，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测。

1.5 DPO-PCR退火温度不敏感性试验 利用建立的DPO-PCR方法，在48℃～68℃退火温度范围进行PCR反应，经琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果，并与常规PCR引物进行对比。

1.6 DPO-PCR灵敏度试验 将菌体浓度约为1.2×107cfu/mL的C.jejuni进行10倍梯度稀释，使用试剂盒提取每级稀释度细菌基因组DNA，以此作为模板进行DPO-PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳分析，以确定该方法的检测灵敏度。

1.7 DPO-PCR特异性试验 利用建立的DPOPCR方法检测各菌株，以验证该方法的特异性。

1.8 临床样品的检测 将建立的DPO-PCR检测方法应用于检验检疫实际工作中，采用国家标准(GB/T 4789.9-2008食品卫生微生物学检验-空肠弯曲菌检验）对其检测结果进行复验，以验证该方法的可靠性。

2 结 果

2.1 D PO-PCR检测方法的建立 以C.jejuni的gyrA基因为靶基因，设计DPO引物，经反应体系优化，建立了C.jejuni的DPO-PCR检测方法(图1）。最佳反应体系(25 μL）为：10×PCR Buffer(Mg2+free）2.5 μL，TaqDNA 聚合酶(5 U/μL）0.1 μL，Mg2+(25 mM）1.5 μL，dNTP(2.5 mM）1.5 μL，上 /下游DPO 引 物(10 μM）各 1.0 μL，DNA 模 板 0.5 μL，ddH2O 16.9 μL。

图1 空肠弯曲菌DPO-PCR检测方法的建立Fig.1 Development of DPO-PCR method for detection ofC.jejuni

2.2 DPO-PCR退火温度不敏感性 PCR反应体系在48℃～68℃退火温度范围内，DPO引物均能够保持高效率扩增，而且无非特异性条带产生，表明DPO引物具有较宽的退火温度范围(图2A），而常规PCR引物的退火温度需要进行优化(图2B）。

2.3 DPO-PCR方法灵敏度 浓度为1.2×107cfu/mL的C.jejuni经105倍稀释后，利用建立的DPO-PCR方法检测，结果表明该检测方法的灵敏度为1.2×102cfu/mL(图 3）。

2.4DPO-PCR方法特异性 结果显示，利用DPO引物能够特异性地检测出1.1所示C.jejuni，与其它菌株无交叉反应，而且不产生非特异性扩增(图4A）；常规PCR引物虽能够检测出目标菌，但存在非特异性反应(图4B）。

2.5 临床样品的检测结果 利用建立的DPO-PCR方法对采集的90份禽粪便拭子、22份污水、30份鲜鸡肉、27份鲜牛奶和15份奶制品等样本进行检测，共检出17份C.jejuni阳性样品，经GB/T 4789.9-2008法复验，两者检测结果相符，显示该方法具有良好的实用性。

图2 DPO引物退火温度不敏感性Fig.2 Annealing temperature insensitivity of DPO primers

图3 C.jejuniDPO-PCR检测方法灵敏度Fig.3 Detection sensitivity of DPO-PCR method forC.jejuni

图4 C.jejuniDPO-PCR检测方法特异性Fig.4 Specificity of DPO-PCR method forC.jejuni

3 讨 论

本研究依据DPO设计原则，以C.jejuni的gyrA基因为检测靶基因，设计了一对DPO引物，与常规PCR引物设计步骤相比，DPO引物设计简易，设计过程中不需要反复优化引物的各项参数。DPO引物具有特殊的两级结构，使其退火温度范围较宽。试验结果显示，利用设计的DPO引物在48℃～68℃的退火温度范围内均可实现C.jejuni靶基因的高效扩增，建立检测方法时无需对引物的退火温度进行反复优化，而常规PCR引物的退火温度范围窄，存在最佳退火温度，建立常规PCR方法时，则需要优化退火温度。DPO引物对退火温度不敏感的特性，为多重PCR方法的建立提供了便捷途径。

DPO引物中连接引物5'-端和3'-端的poly I氢键结合力弱，在DPO引物引导PCR扩增时，若引物5'-端或3'-端有3个以上的碱基发生错配，DPO引物就会脱离DNA模板，终止扩增反应，有效地增强了引物的特异性，而阻断了非特异性扩增，同时DPO引物自身以及引物间难形成二级结构，更提高了扩增效率[7]。本研究的特异性结果显示，利用设计的DPO引物能够准确地检测出目标菌C.jejuni，与其它菌株无交叉反应和非特异性扩增，常规PCR引物特异性表现则相对较差，易产生假阳性结果。因此，与常规PCR引物相比，DPO引物特异性更强，设计时无需对引物的特异性反复进行BLAST比对。临床样品检测结果表明，利用建立的C.jejuniDPO-PCR检测方法能够对实际样品中的C.jejuni进行准确检测，具有良好的实用性。

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Development and preliminary application of DPO-based PCR method for detection ofCampylobacter jejuni

XU Yi-gang1,LI Dan-dan2,LIU Zhong-mei1,WU Yan1,WEI Dong-xu1,LI Su-long1*

(1.Technical Centre of Heilongjiang Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau,Harbin 150001,China;2.Technical Centre of Hainan Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau,Haikou 570125,China）

In this experiment,a Dual-priming oligonucleotide(DPO）-based PCR method for detection ofCampylobacter jejuniwas developed usinggyrAgene ofC.jejunias target gene.The DPO-PCR method had a detection limit of 1.2×102cfu forC.jejuni,which was able to efficiently amplify target gene in the annealing temperature range from 48℃to 68℃,showing insensitivity to annealing temperature.Furthermore,the DPO-PCR method had high specificity due to special structure of DPO primers,thus no non-specific amplifications were produced in reaction.In addition,a total 17 positive samples forC.jejuniwere detected from 184 clinical samples by the DPO-PCR method,which was in accordance with the testing result by GB/T4789.4-2008 standard detection protocol.Therefore,the DPO-PCR method provides a novel rapid and sensitive detection method forC.jejuniinfection.

Campylobacter jejuni;gyrA gene;DPO-PCR

S852.61

A

1008-0589(2014）04-0293-04

10.3969/j.issn.1008-0589.2014.04.10

*Correspondingauthor

2013-09-15

国家质检总局科技计划项目(2012IK157、2013IK051）；质检公益性行业科研专项(201310126）

徐义刚(1978-），男，吉林汪清人，高级兽医师，主要从事致病微生物诊断与防治技术研究.

*通信作者：E-mail：ciqlsl@aliyun.com

(本文编辑：彭永刚）