猪瘟病毒E2蛋白靶向化树突状细胞疫苗诱导的BALB/c小鼠体内/外免疫应答的研究

董炳梅，谢金文，魏 凤，孙全文，王爱华，张春玲，沈志强,，王金良*

(1.山东绿都生物科技有限公司，山东滨州 256600；2.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州 256600；3.河北北方学院，河北张家口 075051）

猪瘟病毒E2蛋白靶向化树突状细胞疫苗诱导的BALB/c小鼠体内/外免疫应答的研究

董炳梅1，谢金文2，魏 凤2，孙全文3，王爱华3，张春玲1，沈志强1,2，王金良2*

(1.山东绿都生物科技有限公司，山东滨州 256600；2.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州 256600；3.河北北方学院，河北张家口 075051）

为确定猪瘟病毒(CSFV）糖基化E2蛋白(Gly-E2）的免疫效力，本研究首先利用体外糖基化修饰技术，在对E2蛋白(E2）进行N-糖基化修饰的基础上，分别进行Gly-E2、DCs与T细胞体外共培养并接种BALB/c小鼠。通过ELISA方法对细胞上清液及BALB/c小鼠血清中IFN-γ、IL-4及IgG含量进行测定，结合体外试验中CTL特异性杀伤率的检测，综合评价该疫苗的免疫效果。结果显示，CSFV E2的糖基化修饰显著增强了DCs的抗原提呈功能，可以同时促进Th1与Th2免疫应答，但主要以Th2体液免疫应答为主，刺激机体产生了快而持久的抗体保护，并且具有良好的免疫记忆，其免疫效果显著优于CSFV与E 2；同时，随着Gly-E2浓度的提高，效应细胞的杀伤率均明显升高，表明Gly-E2可以更有效的刺激效应细胞的杀伤作用。以上结果表明，Gly-E2对提高CSFV的免疫反应具有良好的效果，作为新型疫苗开发的优选抗原，Gly-E2具有很深的开发潜力。

猪瘟病毒；E2蛋白；树突状细胞疫苗；免疫效力

猪瘟是由猪瘟病毒(Classica swine fever virus，CSFV）引起的一种急性、热性、接触性传染病，死亡率极高，是危害我国养殖业的主要传染病之一[1]。E2是引起猪产生针对CSFV保护性抗体的主要抗原，其含量是影响疫苗效力的决定性因素。据报道，将E2基因与杆状病毒重组，并在昆虫细胞中表达的E2可以保护接种猪免受强毒的攻击[2]。另有报道，以腺病毒为载体，重组表达的E2对鼠、兔与猪均显示了完全保护[3]。

蛋白质的糖基化修饰是真核生物的一种最普遍的翻译后修饰方式，体内50%～70%的蛋白质可以发生糖基化修饰[4]，该反应对蛋白质功能具有重要影响。首先，糖基化修饰极大地改变了蛋白质的理化性质：如分子量增加、溶解性增大及蛋白质的折叠、运输和定位等[5-6]。其次，经糖基化修饰后的具有独特生物活性的糖蛋白，可以参与到机体生命活动的各个领域中，如免疫保护、病毒复制、炎症的产生等等[7-9]。目前，应用糖基化工程，已将人类重组人红细胞生成素的高度糖基化类似物在酵母中表达，使该药物在鼠和狗体内的半衰期延长了3倍[10]。Claudia等报道，当FcgRⅢα的Asn162位没有糖链时，抗体对FcRⅢα的亲和性可以降低一个数量级之多[11]。

树突状细胞(Dendritic cells，DCs）疫苗目前在人类肿瘤、乙肝等疾病的治疗中已得到了广泛应用，并取得了良好的防治效果，但在畜牧业生产中仍鲜有报道。DCs是机体最强大的专职抗原提呈细胞，未成熟的DCs表达高水平的甘露糖受体(Mannose receptor，MR），能够有效地捕获甘露糖化的抗原分子。因此，本研究根据DCs膜表面所特有的MR，将克隆表达的E2进行体外糖基化修饰，从而构建了靶向化猪瘟树突状细胞疫苗。

1 材料和方法

1.1 C S F V靶向化树突状细胞疫苗 依据相关报道，本实验室在对E2进行原核表达的基础上[12]，应用α-D-甘露吡喃异硫氰酸苯酯对E2 3个ε-赖氨酸糖基化位点进行体外糖基化修饰，经含糖量测定与质谱分析确定E2已被糖基化[13]，并由本实验室冻存。

1.2 主要试剂 淋巴细胞分离液购自上海普飞生物技术有限公司；小鼠 IL-4与 GM-CSF、 IFN-γ与IL-4 ELISA检测试剂盒购自R&D公司；以CSFV包被的ELISA抗体检测试剂盒购自山东绿都生物科技有限公司。

1.3 实验动物 6周龄～8周龄雄性健康BALB/c小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于山东绿都生物科技有限公司动物房，室温23℃±2℃，供给全价饲料，自由采食、饮水。

1.4 B A L B/c小鼠淋巴细胞的制备

1.4.1 小鼠单核细胞源DCs的制备取6周龄～8周龄BABL/c小鼠，眼球采血，采用淋巴细胞分离液制备单个核细胞层，37℃5%CO2培养，将贴壁细胞转移至含有GM-CFS和IL-4的RMPI1640培养基中进行诱导，至第7 d，加入EDTA/PBS溶液作用20 min，贴壁细胞即为单核细胞源DCs。

1.4.2 T淋巴细胞的制备将BABL/c小鼠迫杀，取其淋巴结制备淋巴细胞悬液，并利用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，以E玫瑰花环试验分离T淋巴细胞。

1.5 G l y-E 2体外免疫效果分析 将未成熟的DCs分成4组，第1、2组分别为未用抗原诱导的空白对照组与CSFV组，第3、4组分别为E2组与Gly-E2组，终浓度0.03 nmol/L。将4组细胞37℃培养16 h～24 h，各组 DCs以2.5×103个/孔分别加入 96孔板中。将T细胞加入上述含有DCs的96孔板中，5×104个/孔，37℃培养24 h～96 h。在不同时间收取细胞上清液，应用ELISA试剂盒对以上4组细胞培养上清液进行IFN-γ和IL-4检测。

1.6 G l y-E 2诱导的C T L特异性杀伤的检测 将DCs分为6组，第1、2组分别为未用抗原诱导的空白对照及CSFV对照组，第3～6组分别加入终浓度为0.03 nmol/L E2，0.03 nmol/L Gly-E2，0.06 nmol/L E2，0.06 nmol/L Gly-E2。将6组细胞37℃培养16 h～24 h，加入96孔板中，2.5×103个孔；将T细胞加入上述含有DCs的96孔板中，5×104个孔，37℃培养96 h；将经DCs刺激的效应细胞与靶细胞分别按 5∶1、10∶1 和 25∶1 加入 96 孔板中，5×103个靶细胞/孔，终体积为200 μL/孔。应用试剂盒检测特异性靶细胞杀伤率。

1.7 G l y-E 2免疫接种B A L B/c小鼠效果分析

1.7.1 免疫接种 将BALB/c小鼠20只随机分为4组，即生理盐水对照组、疫苗对照组、E2组与Gly-E2组。取E2或Gly-E2与弗氏佐剂混匀乳化，皮下注射；对照组注射等量生理盐水；首免14 d后进行第二次免疫，在不同时间点眼球采血，制备血清。

1.7.2 血清中IgG含量的测定将血清进行100倍稀释，按照ELISA试剂盒说明书方法测定不同免疫时期血清中IgG抗体效价。

1.7.3 血清中IFN-γ与IL-4含量的测定采用ELISA试剂盒对以上4组血清中IFN-γ和IL-4水平进行检测，具体方法按照试剂盒说明书进行。

1.8 数据分析 数据以SPASS19.0统计软件包进行统计分析，计量数据以均数±标准差(x±s）表示，结果进行t检验，p<0.05为差异显著，p<0.01为差异极显著。

2 结 果

2.1 Gl y-E 2体外免疫效果分析

2.1.1 细胞培养上清液中I L-4水平的测定 细胞共培养4 h后，Gly-E2组与E2组IL-4水平差异不显著(p>0.05），但显著高于CSFV组(p<0.01）；培养至8 h，3组IL-4水平差异不显著(p>0.05）；培养12 h～24 h，CSFV组与Gly-E2 IL-4水平均显著高于E2组(p<0.01），其中在24 h，Gly-E2组上升至最高水平，显著高于另两组(p<0.01）；36 h～72 h，3组细胞培养上清液中IL-4水平均有所下降，其中Gly-E2组显著高于另两组(p<0.01）(图1）。

图1 细胞培养上清液中IL-4水平的测定Fig.1 The level of IL-4 in cell culture medium

2.1.2 细胞培养上清中IFN-γ水平的测定细胞共培养 4 h～8 h，Gly-E2与 E2 IFN-γ水平显著高于CSFV组(p<0.05）；共培养12 h，CSFV组与E2组IFN-γ水平差异不显著(p>0.05），但显著低于Gly-E2组(p<0.01）；培养至24 h，3组IFN-γ水平均上升至最高点，其中Gly-E2组显著高于另两组(p<0.01）；培养至36 h，3组IFN-γ水平均有所下降，但差异不显著(p>0.05）；培养48 h～72 h，Gly-E2组IFN-γ水平显著高于另两组(p<0.05）(图2）。

综上所述，与CSFV组及E2组相比，虽然Gly-E2提高了Th1细胞免疫应答，但仍以Th2体液免疫应答为主，并且免疫效果显著优于CSFV与E2，并具有良好的免疫记忆。

图2 细胞培养上清液中IFN-γ水平的测定Fig.2 The level of IFN-γ in cell culture medium

2.2 G l y-E 2诱导的特异性靶细胞杀伤率的测定应用不同浓度的蛋白刺激DCs，通过特异性靶细胞杀伤率检测试剂盒测定不同效靶比例条件下，Gly-E2诱导的效应细胞对靶细胞的杀伤率。通过统计学分析，在不同效靶比的条件下，Gly-E2与E2的效应细胞对CSFV的杀伤率明显高于对照组(p<0.01）。负载不同浓度Gly-E2的DCs刺激效应细胞的杀伤率均显著高于E2(p<0.01）。同时随着蛋白质浓度的提高，DCs刺激效应细胞的杀伤率均明显升高(p<0.01）(图3）。以上结果表明，E2的糖基化修饰显著增强了DCs的抗原提呈功能，从而能够更有效的刺激效应细胞的杀伤效应。

图3 DCs诱导的T细胞特异性杀伤活性Fig.3 The specific T cell killing activity induced by DCs

2.3 B A L B/c小鼠免疫保护性试验

2.3.1 血清中IgG水平的测定应用ELISA试剂盒对血清中IgG水平进行测定，结果表明，3组抗体水平均逐渐升高，CSFV组免疫后35 d抗体水平达最高值，E2与Gly-E2免疫后28 d达最高值，免疫期间，Gly-E2组抗体水平均显著高于另两组(p<0.05）。同时Gly-E2免疫56 d后，抗体水平仍保持较高水平。表明Gly-E2可以刺激机体产生快而持久体液免疫应答，并且具有良好的免疫记忆(图4）。

图4 BABL/c小鼠免疫后血清抗体水平的测定Fig.4 The IgG levels in serum of BALB/c mice

2.3.2 血清中IL-4水平的测定应用ELISA试剂盒对BALB/c小鼠血清中IL-4与INF-γ水平进行测定，结果表明，免疫后7 d～35 d，IL-4水平逐渐增长，免疫后42 d～56 d，IL-4水平逐渐回落，并且达到稳定期，与对照组相比差异均显著(p<0.01）。其中免疫后7 d，3组IL-4水平差异不显著，至14 d，Gly-E2组IL-4水平显著高于CSFV组与E2组(p<0.05）；免疫后21 d，3组IL-4水平虽有所增长，但差异不显著(p>0.05）；免疫后28 d，CSFV组与E2组IL-4水平差异不显著，至35 d，CSFV组IL-4水平显著高于E2(p<0.05），但显著低于Gly-E2组(p<0.01）；免疫42 d，2组IL-4水平差异不显著；免疫56 d，CSFV组与E2组IL-4水平差异不显著，但显著低于Gly-E2组(图5）。

图5 BABL/c小鼠血清中IL-4水平的测定Fig.5 The IL-4 level in serum of BALB/c mice

2.3.3 血清中IFN-γ水平的测定应用ELISA试剂盒对BALB/c小鼠血清中INF-γ水平进行测定，结果表明，免疫后7 d～28 d，血清中IFN-γ水平逐渐上升，35 d后开始下降，至56 d，达到稳定期；其中，免疫7 d后，CSFV组IFN-γ水平显著高于E2组与Gly-E2组，免疫后14 d，3组IFN-γ水平差异不显著；免疫后21 d～28 d，Gly-E2组 IFN-γ水平略高于CSFV组(p>0.05），但显著高于E2组(p<0.01）；免疫后35 d～42 d，CSFV组IFN-γ水平显著高于E2，但二者均显著低于Gly-E2组(p<0.01）；免疫56 d，Gly-E2组IFN-γ水平显著高于E2组(p<0.01），但与CSFV组差异不显著(p>0.05）(图6）。

图6 BABL/c小鼠血清中IFN-γ水平的测定Fig.6 The IFN-γ level in serum of BALB/c mice

综上所述，以上结果表明，Gly-E2主要增强了机体的体液免疫应答，并且产生了良好的免疫记忆，细胞免疫应答虽有所增强，相比较弱。该结果与体外测试结果相同，从而证明了Gly-E2具有良好的免疫效力，可以作为疫苗发展的潜在力量。

3 讨 论

猪瘟新型疫苗的研究和开发呈现出许多新景象。猪瘟标记疫苗是对猪瘟兔化弱毒进行改造，使其缺失一种抗原蛋白或抗原决定簇，但其免疫原性不变，因此该疫苗可以用配套的诊断试验将免疫接种猪与自然感染猪区分开[14]。DNA疫苗技术能够同时诱导机体产生体液和细胞免疫反应，因不存在活疫苗毒力反强的潜在危险，已广泛应用于抗CSFV疫苗的研究中，但其免疫原性通常要比完整的抗原弱，需要多次免疫并配合佐剂才能提供有效保护[15]。因此，如何提高该类疫苗的免疫原性是需要重点解决的问题。猪瘟基因重组疫苗是以无致病力或低毒力的痘病毒和伪狂犬病毒为载体，将CSFV E2基因与之重组研制出的疫苗，免疫动物后可以对2种病毒均产生保护力，但其安全性和实用价值目前还具有很大争议。但针对我国畜牧业生产现状，疫苗免疫仍是防制猪瘟的主要措施，因而研制开发安全、高效、稳定的猪瘟疫苗仍是当前兽医科研工作的重点。

蛋白质糖基化是真核生物常见的蛋白质翻译后修饰过程，经糖基化后，蛋白质分子表面的糖链可以对蛋白质分子的功能产生深远的影响。研究表明，细胞表面的糖链被认为是“分子天线”，一方面参与细胞识别，另一方面参与抗原与抗体及抗体Fc段与其受体FcR的相互识别，从而诱发特定的免疫反应。在目前畜牧业范围内，本研究最先使用体外糖基化修饰技术，对CSFV E2进行了N-糖基化修饰，构建了靶向化树突状细胞疫苗，并对其免疫保护性进行了研究。该疫苗一方面可以诱导机体快速产生免疫应答，并具有良好的免疫记忆；另一方面还可以避免自然感染与免疫接种难以区分的弊端，更有利于猪瘟综合预防措施的实施。考虑到生产成本问题，在今后的研究过程中，本实验室一方面将进一步开展免疫剂量及免疫程序的研究；另一方面将进行免疫保护剂及免疫佐剂的筛选，向低成本、高产率、更安全的产业化方向努力。该研究的进一步实施，必将为猪瘟新型疫苗的开发与该疫病的防控提供新的技术方法与策略。

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The immune response of classic a swine fever virus E2 protein targeting to dendritic cell vaccinein vivo/vitroof BALB/c mice

DONG Bing-mei1,XIE Jin-wen2,WEI Feng2,SUN Quan-wen3,WANG Ai-hua3,ZHANG Chun-ling1,SHEN Zhi-qiang1,2,WANG Jin-liang2*

(1.Shandong Lvdu Bio-technology Co.,LTD,Binzhou 256600,China;2.Shandong Binzhou Animal Science and Veterinary Medicine Insitute,Binzhou 256600,China;3.Hebei North University,Zhangjiakou 075051,China）

In order to evaluate the immune efficacy of glycosylated E2 protein(Gly-E2）of classic swine fever virus(CSFV）,the Gly-E2,dendritic cells(DCs）and T cells were co-cultured and the BALB/c mice were inoculated with the Gly-E2.Consequently,the IL-4,IFN-γ and IgG levels in cell culture supernatant and serum of BALB/c mice were detected by ELISA,and the rate of CTL specific killing was evaluatedin vitro.The results show that the glycosylation of E2 enhanced antigen presentation of dendritic cells significantly,and promoted the Th1 and Th2 immune response at the same time.In addition,the Th2 humoral immune response was more significant.The Gly-E2 sitimulated the body to produce quick and more durable antibody and had a better immune memory than that of CSFV and E2.Furthermore,the rate of killing effector cells significantly increased in a dose depend manner with the Gly-E2.These results proved that the Gly-E2 possessed a good preventive effect to classical swine fever.Therefore,the Gly-E2 has a potential for development of new vaccines.

classica swine fever virus;E2 protein;dendritic cell vaccine;immunel efficiency

S852.65

A

1008-0589(2014）04-0305-05

10.3969/j.issn.1008-0589.2014.04.13

*Correspondingauthor

2013-05-18

山东省自然科学基金项目(ZR2010CQ012）；河北北方学院重大项目(zd201307）

董炳梅(1979-），女，河北沧州人，硕士，助理研究员，主要从事预防兽医学与基因工程疫苗的研究.

*通信作者：E-mail：Wangjinliang1978@yahoo.com.cn

(本文编辑：李 爽）