二根龙蛭汤对脑缺血模型大鼠神经细胞凋亡的影响＊

范小璇 顿宝生 强选平 赵晓平 逯 莉 陕西中医学院附属医院外四科（咸阳 712000）

脑缺血发生后，常常导致患者学习记忆、肢体、语言等功能障碍，这些功能障碍的出现都是神经元损害的结果。神经元对缺血性损害的敏感性不一，凋亡与坏死并存，凋亡主要出现在缺血半暗带，是迟发型神经元损害的主要形式[1]。二根龙蛭汤是我们临床总结的经验方，对缺血性中风等疾病治疗效果明显，为了揭示其作用机制，进行了本项研究，现汇报如下。

1 材料与方法

1.1 动物及分组 选用SD成年大鼠40只，体重200±50g，雌雄各半（由西安交通大学医学院实验动物中心提供，合格证号SCXK 2012-003）。随机分为假手术组、模型组、对照组和治疗组，每组10只。对照组给予吡拉西坦片灌胃，治疗组给予二根龙蛭汤（葛根、白茅根、地龙、水蛭、丹参、红花、川芎）灌胃治疗。

1.2 造 模 参考文献[2－3]制作脑缺血模型。所有动物购回后适应性喂养7d，术前12h禁饮食，自由饮水。称重后用10%水合氯醛（3.5mL／kg）腹腔注射对大鼠麻醉，麻醉成功后将大鼠固定在鼠板上，颈部剃毛、皮肤消毒后，取正中切口，仔细分离右侧颈外动脉、颈内动脉，用丝线结扎颈外动脉，颈内动脉远端放置动脉夹；将头皮针端口打磨光滑，把头端涂有石蜡油的尼龙渔线从颈外动脉靠近分叉处导入血管内，去掉动脉夹，在直视下缓慢推进渔线入颅，遇到阻力后停止，入颅约1.8cm；将颈内动脉连同渔线一起结扎，放开颈外动脉结扎线，缝合皮肤。假手术组只切开颈部皮肤、暴露血管后缝合皮肤。

1.3 治 疗 所有动物术后给予红霉素软膏涂抹伤口，假手术组和模型组术后6h开始给予进食进水，对照组术后6h给予进食水的基础上吡拉西坦片（由宜昌人福药业有限责任公司生产，按人与实验用鼠比为1∶10进行换算后以3.6g／Kg·d剂量灌胃）灌胃进行治疗，治疗组术后6h给予进食水的基础上给予二根龙蛭汤（由陕西国际商贸学院医药学院实验室提供，根据体重按人正常用量的10倍）浓缩煎剂灌胃治疗。

1.4 Morris水迷宫实验 大鼠购回后第3d开始进行水迷宫训练，连续3d，术后第4d再次进行训练3d，第7d进行水迷宫实验。放置一直径1.3m、深0.5m的圆形水池，池壁为白色，标明Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四个象限，在任何一象限内放置一个直径10cm、高25cm的安全平台，水面没过平台5cm，水中注入适量奶粉，以目视看不见平台为宜，水温控制在25℃左右。记录大鼠寻找到安全平台时间，即逃避潜伏时间；再撤去平台，选第Ⅱ象限入水点将大鼠面向池壁放入水中，记录90s内大鼠跨越原平台次数。

1.5 指标测定 第7d水迷宫实验结束后10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，开胸经左心室穿刺，生理盐水冲洗灌洗，见肝脏颜色发白后4%甲醛灌注固定，开颅取脑，冠状面冰冻后切片，片厚6um。按照Bax、Bcl-2免疫组化试剂盒说明步骤进行。在40倍显微镜下观察阳性标记物标记细胞的数量，进行统计分析。

2 结 果 本组实验过程中，共死亡大鼠4只，其中模型组2只，治疗组和对照组各1只。治疗后第7d水迷宫实验结果见表1，Bax和Bcl-2实验结果见表2。

表1 治疗后7d水迷宫实验结果比较

表2 治疗后7dBax、Bcl-2结果比较

3 讨 论 脑缺血属于中医“中风”的范畴，《素问·风论》云：“风者，百病之始也。”正虚邪实而中风。清·喻昌在《尚论后篇·真中》云：“中风之风乃人身自有之风，平素蕴蓄，而一旦内出者也。”“血瘀”为中风的病机关键，补阳还五汤用于治疗中风病的临床疗效被广泛认可，故而，活血化瘀治疗成为治疗的主要大法。经验方二根龙蛭汤由葛根、白茅根、地龙、水蛭、丹参、红花、川芎七味药组成。水蛭、地龙共为君药，水蛭咸、苦、平而归肝经，破血、逐瘀、通经，地龙咸、寒归肝、脾膀胱经，息风通络、利水，二药共用使瘀血消散，闭阻之经络畅通；臣以丹参、红花、川芎，丹参苦、寒，归心、肝经，具有活血调经、凉血安神之功效，红花心温，归心、肝经，具有活血通经、祛瘀止痛之功效，二者相须为用，功专于化瘀，再加活血行气、祛风止痛之川芎，能上行头目，旁通络脉，使瘀血去、经脉通，头痛止，意识清；佐以葛根，甘辛凉，解肌退热，扩管通脉，使药白茅根甘、寒，凉血止血，清热利水，使热散而血止，湿渗则水利；全方共奏化瘀通络利水之效。

本项研究结果显示，模型组大鼠逃避潜伏期时间较假手术组明显延长，说明造模成功，二根龙蛭汤治疗后，脑缺血大鼠逃避潜伏期较模型组缩短，跨越平台次数增加，说明二根龙蛭汤有改善脑缺血大鼠学习记忆功能的作用。研究表明，Bcl-2具有明显的抗细胞凋亡和延长细胞寿命的作用[4]，Bcl-2蛋白家族是细胞凋亡调控蛋白，Bcl-2／Bax基因是目前研究较为明确的一对在功能上相互对立的凋亡调控基因[5]。本研究表明，二根龙蛭汤能抑制脑缺血模型大鼠Bax的升高，促进Bcl-2的升高，说明二根龙蛭汤能减轻脑缺血大鼠神经细胞的凋亡，从而减轻神经功能的损害。

总之，二根龙蛭汤对脑缺血大鼠学习记忆能力具有明显的改善作用，可能是通过减轻神经细胞凋亡的作用来实现的。

[1]吴 限，陈 鹏.心脑通络液对脑梗塞大鼠脑组织凋亡基因 Bcl-2、p53的影响[J].中医药信息，2011，28（4）：64-65.

[2]张荣媛，张宏伟，尚爱加.大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型制备及行为学评价标准的改进[J].军医进修学院学报，2008，88（1）：211-247.

[3]包新杰，赵 浩，赵英杰，等.线栓法插线深度对大鼠脑梗死模型制备的影响[J].中国实验动物学报，2011，19（3）：233-236.

[4]刘 星，宿宝贵，吕来清，等.电针上调脑梗塞大鼠皮质缺血半影区Bcl-2蛋白质的表达[J].解剖学研究，2010，32（2）：88-92.

[5]薛 茜，邹玉安，赵宝民，等.脑缺血再灌注半暗带细胞凋亡及Bcl-2／Bax比值的变化及中药干预机制[J].陕西中医，2010，31（7）：926-927.