不同时机针刺介入对TBI模型大鼠NGF蛋白表达及mRNA水平调控的实验研究＊

郭新荣 王瑞辉 吴 涛 史海龙 屈红艳 陕西中医学院（咸阳 712046）

NGF（nerve growth factor，NGF）是最早发现的典型的神经营养因子、研究最为广泛、最深入，其在神经细胞的发育、轴突的生长及递质的合成和细胞的凋亡等多个环节中发挥着重要的调控作用[1]。NGF能促进外周及中枢神经元的分化、生长和存活，在维持大脑正常的生理功能中发挥着极其重要的调节作用[2]。本研究旨在观察针刺不同时间干预治疗TBI的效果，选用NGF作为观察指标。

1 材料及方法

1.1 动物及分组 实验大鼠（批号：20121023）由西安交通大学实验动物中心提供，体重220～240g，适应性饲养3d，随机分为空白（A）、针刺1（B）、针刺2（C）、针刺3（D）和模型（E）组。

1.2 主要实验仪器设备及试剂 全自动脱水机（ZT-12J）、切片机（JJQ-P2016J，均湖北省孝感市亚光医用电子技术有限公司）；包埋机（JB-L6，武汉俊杰电子有限公司）；冷冻高速离心机（德国eppendorf centrifuge 5417R）；PH酸度计德国（（Sartorius PB-10），赛多利斯科学仪器（北京）有限公司）；微型脱色摇床（TY-80S型，南京新校园生物技术研究所）；电泳槽（美国 BIO-RAD；转印槽（美国BIO-RADMini Trans-Blot®Cell）；NanoDrop微量核酸定量仪（Thermo Fisher Scientific，Inc）；荧光定量PCR设备（美国伯乐IQ5）。

TransScript All-in-One First-Strand Cdna Synthesis Super Mix for qPCR试剂盒、TransStar Top Green qPCR SuperMix试剂盒（均北京全式生物技术有限公司）引物合成（由南京金斯瑞生物科技有限公司提供）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（北京诺博莱德科技有限公司）；Blue Plus II Protein Marker（14KDa-100KDa）、Anti-β-actin Mouse Monoclonal Antibody、Goat Anti-Rabbit IgG（H＋L），HRP Conjugate、Goat Anti-Mouse IgG（H＋L），HRP Conjugate（均北京全式生物技术有限公司）；NGF beta Rabbit Monoclonal Antibody（美国 EPITMICS公司）；ECL Plus荧光检测试剂盒（MILLIPORE）；Rabbit Anti-NGF一抗、兔源二抗IgG－兔免疫组化试剂盒SABC即用型、DAB显色试剂盒（均武汉博士德生物工程有限公司）。

1.3 TBI模型制备 术前禁食8h。实验时腹腔内注射2%的戊巴比妥钠（75mg／kg）进行麻醉，俯卧位固定于脑立体定向仪上。消毒皮肤，正中切开，剥离骨膜 ，暴露右顶骨，用微型磨钻在冠状缝后3mm、中线右旁2.5mm处钻一直径为2mm的骨窗，保持硬膜完整。将大鼠移置到电子颅脑损伤仪（eCCI-6.3，美国VCU大学设计）操作台上，调试好机器参数（打击速度4m／s、深度3mm），对B、C、D和E组动物全部进行打击，撞击杆撞击硬膜，使脑组织产生瞬间形变。打击后向切口内滴注4万单位硫酸庆大霉素4～5滴 ，骨蜡封闭骨窗 。缝合头皮，外涂抹红霉素软膏。造模后，放回笼中，单独喂养。

1.4 治疗方法 取穴“百会”、“人中”、左侧“内关”、“足三里”[3]。定位参照《实验针灸学》并结合人体同身寸取穴法。空白组、模型组，正常饲养；B、C、D组分别于造模后第1、3、5d开始针刺治疗，1d1次，连续10次。操作方法：75%乙醇棉球穴位消毒，选28号0.5寸华佗牌毫针、常规消毒，百会向前斜刺、人中直刺，内关、足三里直刺，刺入深度均为2～3mm，各穴均行捻转手法，前后捻转各360°左右为1次，共捻转30次启针。

1.5 实验检测 所有动物于造模后第15d取材，分别进行以下检测：免疫组化：标本经固定后制成4um厚的石蜡切片，采用SABC染色法。光学显微镜下观察切片中组织染色机NGF蛋白表达情况。

Western blot法检测NGF蛋白含量：取损伤脑组织，过液氮，用高效RIPA提取蛋白、BCA进行蛋白定量。使用5×SDS上样缓冲液煮沸5min制备10ug／ul样本，冷却到室温，12000转／分的低温高速离心机离心5min，取上清4℃冰箱保存供电泳使用；使用12%的分离胶10mL、5%的浓缩胶5mL灌胶，上样10ul；60V低电压跑约30min，、90V电泳跑约90min进行电泳；转膜（400mA，2.0h）；5%milk脱色摇床上摇60min；孵一抗冰箱过夜（1：3000）；TBST10min×2次、TBS5min×1次，孵二抗（1：5000，常温3～5h；TBST10min×2次、TBS5min×1次；ECL发光，5S～45S；X线压片、显影、定影。以β-actin作为内参。

定量PCR检测mRNA含量：取损伤脑组织，过液氮，用Trizol试剂提取总RNA；使用NANO核酸核糖测定仪测定所提取的RNA的浓度，调整RNA的浓度到10ug／ul；反转录为DNA（按试剂盒说明操作）；利用NANO测定DNA纯度、浓度，调整DNA浓度为20ng／ul；荧光定量PCR反应（参考试剂盒说明操作），NGF上游引物：5’＞CTTCAGCATTCCCTTGACAC＜3’、下游引物：5’＞AAGCCTTCCTGCTGAGCACACA＜3’，β-actin上游引物：5’＞TCATGAAGTGTGACGTGGACATC＜3’，下游引物：5’＞TGTTGCATTTGCGGGGACGATG＜3’，循环参数：95℃5min预热，95℃10S、30℃30S、72℃30S共循环共40次，72℃5min，55℃30S、温度梯度为0.5℃，溶解曲线（Melt crave）共81各循环。

1.7 统计学方法 采用SPSS17.0软件包进行数据分析。

2 结 果

2.1 免疫组化 免疫组化图片采用陕西中医学院分子生物与免疫组化实验中心Motic images Advanced 3.0图像分析系统，检测NGF阳性表达物情况，在400倍光镜下随机选择5个相邻视野，计算阳性表达细胞数，取5个视野的平均值。

表1 SD大鼠脑皮层NGF蛋白表达的比较（）

表1 SD大鼠脑皮层NGF蛋白表达的比较（）

注：△与空白组比较P＜0.01，▲与模型对照组比较P＜0.01，◇与针刺1组比较P＜0.01，◆与针刺2组比较P＜0.01。下同

组 别 n 8 39.78±10.27针刺1组 8 58.78±12.54▲针刺2组 8 53.43±8.11▲◇针刺3组 8 49.28±9.91▲◇◆模型组 8 30.83±11.31阳性细胞计数空白组△

图1 各组SD大鼠脑皮层NGF蛋白表达（×200）

2.2 Western-blot法结果 X-RAY图像结果利用扫描仪扫描成图片，再利用Kodak Digital Science 1D软件分别计算NGF和β-actin各条带的灰度和面积之乘积，最后分别计算出NG与β-actin的比值，即得到各蛋白表达的相对百分含量。各组结果利用（）表示。

表2 SD大鼠脑皮层NGF蛋白WB检测灰度值比较（）

表2 SD大鼠脑皮层NGF蛋白WB检测灰度值比较（）

组 别 n 8 7.06±1.28针刺1组 8 14.98±0.85▲针刺2组 8 13.55±1.43▲◇针刺3组 8 12.22±1.04▲◇◆模型组 8 5.55±1.23灰度值空白组△

图2 脑组织皮质区NGF蛋白含量的表达

2.3 荧光定量PCR结果 以β-actin的循环阈值（threshold cycle，CT值定义为每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数）作为内参，计算目标基因与内参的差值ΔCT（ΔCT＝β-actinCT-target gene CT），数据采用2－ΔCT法计算出mRNA的水平。

表3 脑皮质 NGFmRNA含量的比较（2－ΔCT，）

表3 脑皮质 NGFmRNA含量的比较（2－ΔCT，）

组 别 n 2－ΔCT 6 0.022±0.012针刺1组 6 0.292±0.032▲针刺2组 6 0.175±0.023▲◇针刺3组 6 0.049±0.008▲◇◆模型组 6 0.016±0.010空白组△

3 讨 论 中医认为，TBI病位在脑，病机为气滞、瘀血、痰湿阻滞经络导致清窍阻蔽，或者气机逆乱。故治疗原则采用活血化瘀、化痰开窍、疏通经络、调理气机。我们文献研究结果[3]显示，针灸治疗TBI多选督脉、手足阳明经腧穴。其一，督脉与脑有着密切的关系，《难经》有：“督脉者，起于下极之俞，并于脊里，上至风府，入属于脑”的记述，并多次与手足三阳经及阳维脉交会。其二，从功能上看，督脉有“总督诸阳”之功，为“阳脉之海”，调节全身阳经，且对整个经脉系统有统帅作用。其三，现代研究也认为督脉位居身体的中轴线上，通过双侧神经调节，能起到促进脑功能的代偿和重组作用。阳明经脉多气多血，TBI因气滞、气乱、血瘀造成，故多用阳明经上的穴位来活血化瘀、行气通经。

本研究中，选用的腧穴为百会、人中、内关和足三里。百会为“三阳五会”，穴居巅顶，属督脉通于脑，具有醒脑安神、升清化浊的作用。针刺督脉百会穴，可以改善大鼠自由基代谢，促进受损神经元修复，提高其学习记忆能力的作用，同时能减轻脑水肿，有助于瘀血的消散吸收，对脑缺血及再灌注损伤具有一定的保护作用。另外，有研究认为百会位于大脑的前动脉主干投影区，也为皮层运动、感觉区上部的投影区，针刺百会对改善大脑的前动脉血液循环，兴奋皮层运动区，感觉区有重要意义。人中为督脉经与手阳明大肠经及足阳明胃经之交会穴，有清热开窍，镇痛宁神，回阳救逆，祛风止痛之功。现代研究表明，针刺人中能兴奋脑神经元、整合复杂的中枢神经系统、促进脑组织血液循环，增加脑灌注量。实验研究也证实人中对脑损伤后意识障碍及脑电图的改善优于其他穴位。足三里为足阳明胃经穴位，选其以扶正，补后天气血生化之源以治本，调和经脉，疏通气血。总之，诸穴合用，可以达到醒脑开窍、通经活络、调整气机之效，促进TBI损伤脑组织的恢复。

Lee的实验表明[4]NGF与许多中枢和周围神经系统病变密切相关，在学习、记忆、神经细胞损伤后的恢复中起重要的调节作用。Dekosky[5]等研究发现创伤性脑损伤中NGF蛋白在大脑皮质明显增加，其mRNA于伤后1d增加5倍，认为NGF在神经损害后神经再生和修复中起保护作用。本研究在不同时间开始针刺治疗TBI的时效作用的实验中，结果免疫组化和Western-blot法检测均发现模型组对照组动物脑组织皮层NGF表达略有降低，同空白组比较有统计学意义（P＜0.05），这可能由于损伤时间较长，在病理情况下升高的NGF没有得到即时的治疗维持、很快的消耗导致，针刺组脑组织中NGF含量均明显高于空白组、模型组，表明针刺对脑组织中NGF的含量确有上调作用。进一步，我们运用荧光定量PCR观测其相应mRNA表达的情况，结果发现针刺对NGFmRNF的表达的调控作用也同样如此。且针刺1组优于针刺2组、针刺3组，针刺2组优于针刺3组，且组间比较具有统计学意义（P＜0.01）。表明针刺介入治疗TBI的时间可能越早越有利于发挥针刺上调脑组织神经元的神经生长因子NGF及相应mRNA表达，达到保护脑组织神经元的作用。

[1]RABACCHI SA，ENSINI M，BONFANTIL，et al.Nerve growth factor reduces apoptosis of axotomized retinal ganglion cells in the neonatal rat[J].Neurosci，1993，63（4）：969-973.

[2]Mobley W C，Rutkowski J L，Tennekoon G I，et al.Choline acetyl-transferase activity in striatum of neonatal rats increased by nerve growth factor[J].Science，1985，229（4710）：284.

[3]郭新荣，王瑞辉，李 娜，等.针刺治疗颅脑损伤用穴规律的现代文献研究[J].时珍国医国药，2013，24（6）：1433-1435.

[4]Lee T H，Kato H，Chen S T，et al.Expression of nerve growth factor and trk A after transient focal cerebral ischemia in rats[J].Stroke，1998，29（9）：1687-1697.

[5]Dekosky S T，Goss J R，Miller P D，et al.Upregulation of nerve growth factor following cortical trauma[J].Exp Neurol，1994，130（2）：173-177.