Design and Implementation for Diarrheic Shellfish Poison Detection Based on Electrical Cell-Substrate Impedance Sensing*

SU Kaiqi，ZOU Ling，WANG Qin，LI Hongbo，CAO Duanxi，ZOU Qichao，ZHOU Jie，HU Ning，WANG Ping

(Biosensor National Laboratory，Key Laboratory of Biomedical Engineering of Education Ministry，Department of Biomedical Engineering，Zhejiang University，Hangzhou 310027，China)

Design and Implementation for Diarrheic Shellfish Poison Detection Based on Electrical Cell-Substrate Impedance Sensing*

SU Kaiqi，ZOU Ling，WANG Qin，LI Hongbo，CAO Duanxi，ZOU Qichao，ZHOU Jie，HU Ning，WANG Ping*

(Biosensor National Laboratory，Key Laboratory of Biomedical Engineering of Education Ministry，Department of Biomedical Engineering，Zhejiang University，Hangzhou 310027，China)

A novel system for fast poison detection based on electrical cell-substrate impedance sensing was proposed and fabricated for resolving the problems of marine diarrheic shellfish poison detection.Comparing with tranditional methods，the system has the performance of simple operation，high consistency and high throughput.In this study，the design of system hardware and software were introduced and then its performance was tested.Finally，toxin detection experiments with Neuro-2a，DSP and OA were used to certify the availability of system.The results showed that the system had some attributes such as fast，long-time monitoring，no invasion and high throughput and applied a new detection platform for DSP of marine productions.

electrical cell-substrate impedance sensing，diarrheic shellfish poison，okadaic acid，poison detection system

海洋水产品毒素是一类由浮游生物产生的非蛋白质小分子化合物。双壳类软体动物或其他贝类动物通过滤食而将这些毒素积存在体内［1-4］。人们由于食用这些水产品而中毒甚至死亡。总的来说，海洋水产品毒素可以根据所引发的症状归为7类:腹泻性贝类毒素(DSP)，麻痹性贝类毒素(PSP)，记忆缺失性贝类毒素(ASP)，神经性贝类毒素(NSP)，氨代螺旋酸贝类毒素(AZP)，鱼肉毒素(CFP)和河豚鱼毒素［5］。DSP中毒症状主要包括恶心、腹泻、呕吐和腹痛等［6］。DSP主要成分为大田软海绵酸(OA)及其酸性派生物毒素(DTXs)［5，7］。OA在1981年首次从大田软海绵中分离出来因此而得名［8］。研究报道OA及其衍生物会抑制具有蛋白质脱磷酸作用的丝氨酸/苏氨酸蛋白酶。目前报道的由DSP引起的中毒事件遍及全球，包括日本、欧洲、美国和中国等［9-11］。根据CE No.853/2004欧盟设置OA含量的标准为不超过160 μg/Kg［12］。因此，如何检测DSP是一个急需解决的热点问题。

目前海洋水产品毒素检测技术包括小白鼠生物法(MBA)、细胞检测、免疫分析、化学分析方法和生物传感器等［13］。小白鼠生物法属于最常用方法并且已成为诸多国家包括欧盟、日本等的官方检测手段［14］。虽然此方法操作简单，但需要杀害大量动物因而违反了动物保护原则［15］。在化学分析方法中，高效液相色谱法由于其能够定性定量分析近年来受到关注，但此方法需要专业人员并且需要耗费大量昂贵试剂［16］。细胞检查法通过检查细胞形态和活性变化来检查海洋水产品毒素，并且由于使用了哺乳动物细胞使得毒素评价更为直观。但由于细胞检查法属于终点检测因而无法监测整个过程［17］。免疫分析法通过抗原抗体反应虽然具有高特异性与灵敏度，但获得其特殊的单克隆抗体是非常困难的并且实验中很容易出现假阳性［18］。近十年来，生物传感器法以其快速、简单和高灵敏度等特点而备受瞩目［19］。细胞传感器利用活细胞作为敏感元件感应到细胞外微环境的波动，并能高效地评估药物的性能［20-22］。细胞阻抗传感器(ECIS)能够通过细胞阻抗检测细胞贴附，迁移和活性等细胞动态变化参数［23］。

本文基于细胞阻抗传感器设计一种海洋水产品腹泻性毒素检测系统，具有新型的、高一致性、高通量等特点，用于海洋水产品毒性的快速检测，是对水产品毒性快速检测方法的补充和发展。本文将详细介绍该系统的软硬件设计，并且通过系统性能测试及毒素检测实验验证系统的可行性。

1 系统设计

1.1 硬件设计

ECIS是一类电化学传感器，通过在参考电极上施加一个微小激励电场，从工作电极上检测出电极/细胞/溶液体系的阻抗。当电极裸露在溶液中时，电极阻抗主要由周围区域的离子环境决定，这一阻抗称为基线阻抗。当细胞贴附到电极上后，引起区域离子环境和电极/溶液界面特性的改变，从而导致电极/细胞/溶液体系阻抗的变化。细胞分布密度、细胞与电极间距、细胞形态等都能引起这一阻抗发生变化。生物阻抗测量主要分为电压激励电流测量和电流激励电压测量两种方式，本系统硬件设计采用其中的电压激励电流测量的方式进行细胞阻抗测量。

下位机工作流程如图2所示，仪器在上电之后立即进行系统初始化，具体包括晶振、MCU外部控制端口、通道选通、程控放大器及串行总线模块的初始化。进行初始化后，系统下位机通过串口接收上位机端发送的控制指令，并根据预先设定好的通讯协议判断指令是否正确。如符合检测指令，下位机将通过通道切换，循环检测传感器芯片培养板上的16个通道的阻抗值。一轮检测结束后，下位机通过串口将数据传递给上位机系统进行后续处理，之后重新进入等待指令状态。Win_QextSerialPort等进行进一步的封装处理。通信协议类是对系统自定义协议的读取、保存和解析。

图1 腹泻性毒素检测系统

图2 腹泻性毒素检测系统下位机工作流程图

监测层负责控制下位机并接收下位机数据，之后传递给数据处理层进行数据处理。为了保证系统的稳定性，本系统采用主-从模式进行上下位机交互，即上位机处于主要控制地位而下位机应答上位机控制。监测层为控制上下位机交互的主要层次，控制下位机的运行模式。

数据处理层主要是对ECIS数据进行在线处理与保存。ECIS在线处理方法除了监测下位机的阻抗数据，还有根据阻抗数据进行在线细胞指数计算。在进行细胞阻抗测量时，常使用细胞指数来表征细胞状态［25］，其中细胞指数与阻抗之间的关系如下

1.2 软件设计

本系统上位机软件使用Qt Creator进行开发，设计语言采用的是C++。Qt是一个跨平台的C++图形用户界面应用程序框架，提供给应用程序开发者建立艺术级的图形用户界面所需的所有功能。Qt很容易扩展，并且允许真正地组件编程。Qt具有优良的跨平台特性，属于面向对象，并且具有丰富的API，支持2D/3D图形渲染等特点。结合Qt的优良特性，本系统软件为达到可移植性及易维护性等需求，采用了分层架构模式来设计。其主要原则为任一一层元素仅与同一层的其他元素或者下一层元素发生关系。

如图3(A)所示，本系统软件主要分为4个层次，通讯层，监测层，数据处理层和UI显示层等。

通讯层封装了软件系统与系统下位机通讯所需要的协议类，包括串口操作类和通信协议类。通讯层主要完成的功能包括串口参数的设置、打开、关闭、写入、读取和串口的校验。此层也是对Qt串口类包括其中，CIk(t)表示第K个通道的细胞在t时刻的细胞指数，Zk(t)表示第K通道在t时刻的阻抗值，Zk(0)表示第K通道检测初始点的阻抗值，Zk该通道腔内阻抗值。为了能进一步观测毒素溶度变化对细胞的影响，我们采用标准化细胞指数的概念［26］，归一化细胞指数与细胞指数的关系如下

其中，NCIk(t)表示第K个通道的细胞在t时刻的归一化细胞指数，CIk(t)表示第K个通道的细胞在t时刻的细胞指数，CIk(tn)表示第K个通道的细胞在归一化点tn时刻的细胞指数。

UI显示层为系统与用户交互的界面，用户通过对UI界面的操作来控制整个系统。图3(B)为系统软件的主界面，其中区域1为参数设定按钮区域，区域2为程序流程控制按钮区域，区域3为系统16通道实时显示选择区域，区域4为实时数据显示区域。本软件界面显示最主要部分区域4采用QWT进行制作。QWT是一个基于Qt开发的开源项目，其目标是以基于2D方式的窗体部件来显示数据并可生成各种统计图。

图3 腹泻性毒素检测系统软件

2 实验结果与讨论

2.1 系统性能测试

系统性能测试实验采用与ECIS细胞培养板对应的阻抗进行长时程检测，16通道分为40 Ω、70 Ω、95 Ω和120 Ω等，每种阻值各4个通道进行65 h长时监测。系统长时监测系统性能结果如图4所示，表1和表2分别为系统性能测试阻抗和换算CI值的统计结果。阻抗监测结果中变异系数均在0.054%之下，换算CI值波动均在0.01之内。

图4 腹泻性毒素检测系统性能测试

表1 实测16通道40 Ω、70 Ω、95 Ω和120 Ω的系统性能测试阻抗结果

表2 实测16通道40 Ω、70 Ω、95 Ω和120 Ω的系统性能测试CI值结果

2.2 细胞培养

实验所采用的小鼠神经母细胞瘤(Neuro-2a)细胞株由浙江大学动科院方维焕教师惠赠。Neuro-2a细胞培养于含10%胎牛血清、1%的谷氨酰胺、1%的非必需氨基酸、1%的丙酮酸钠、100 μg/mL链霉素、100 u/mL青霉素的RPMI-1640培养基(Gibco. USA)中，于37℃、饱和湿度、5%CO2条件下培养。待细胞长至对数期，用胰酶-EDTA消化液(含胰蛋白酶0.25%，EDTA0.02%)消化细胞，按照1X105细胞/孔的浓度将细胞接种到阻抗芯片上。

2.3 腹泻性毒素检测

待细胞在ECIS培养板上培养16 h后，系统开始监测各个通道阻抗变化。之后8 h，即细胞接种到阻抗芯片上24 h后，分别往实验组加入25 μg/L、50 μg/L和100 μg/L的海洋水产品腹泻性毒素OA标准液。系统毒素检测试验结果如图5所示。

系统毒素检测实验CI指数归一化统计结果如图6所示，CI指数归一化以监测的第4 h为归一化点进行归一化。加药前8 h，随着细胞在ECIS培养板上生长、分裂而数量增加，从而腔内阻抗增加，CI指数增大，此结果与图结果一致。加药后，由于实验组中OA毒素作用，抑制细胞生长，并且浓度越大作用越强，与图所示结果一致。与对照组相比，实验组随着毒素溶度增大，CI指数下降越快。当CI指数达到最大值后，由于腔内营养液消耗殆尽，从而导致细胞凋亡，腔内阻抗变小，最终表现出CI指数的下降。ECIS培养板上对照组与100 μg/L实验组作用下细胞培养情况分别如图7(A)和(B)所示。图7(A)对照组细胞生长状况良好，图7(B)中细胞在毒素作用下密度稀疏。

图5 腹泻性毒素检测系统毒素检测实验结果

图6 腹泻性毒素检测系统毒素检测实验CI指数归一化结果

图7ECIS培养板Neuro-2a细胞培养情况

实验中用浓度为25 μg/L、50 μg/L和100 μg/L的海洋水产品腹泻性毒素OA标准液作用Neuro-2a细胞。从图中看到，相对于不加毒素的空白对照组，其他各组的阻抗在开始的20 h后均呈现快速减小，而其中实验组中最大浓度100 μg/L在10 h内就和对照组有明显下降，之后趋于缓和; OA毒素浓度越高，阻抗下降越快，下降幅度也越大并呈现出梯度分布。实验通过长时监测对照组与实验组的CI值变化，从而检测海洋水产品腹泻性毒素，并且通过CI曲线变化来反映细胞对毒素的长时响应。

3 结论

介绍了一种基于细胞阻抗传感器的腹泻性毒素检测系统，致力于建立基于细胞传感器的快速分析系统平台，用于海洋水产品毒性进行分析评价。本系统包括下位机硬件系统和上位机软件系统，并且在对系统平台的性能测试后，采用神经母细胞瘤细胞(Neuro-2a)结合系统平台的ECIS细胞培养板，通过对腹泻性贝毒(DSP)大田软海绵酸(OA)进行毒性检测，实现了系统平台实时无损快速检测毒素的功能。研究结果表明，基于细胞传感器的海洋水产品腹泻性毒性快速分析系统具备快速，长期，无损和高通量测量的特点，为腹泻性毒素检测提供了新的平台。

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苏凯麒(1990-)，男，浙江大学，硕士研究生，主要研究方向为细胞传感器与海洋水产品毒素检测，sukaiqi@zju. edu.cn;王平(1962-)，男，浙江大学，教授，博士生导师，主要研究方向为传感器与检测技术、生物芯片与生物电子学、人工嗅觉与人工味觉等，cnpwang@ zju.edu.cn。

基于细胞阻抗传感器的腹泻性毒素检测系统设计与实现*

苏凯麒，邹玲，王琴，黎洪波，曹端喜，邹瞿超，周洁，胡宁，王平*
(浙江大学生物传感器国家专业实验室，生物医学工程教育部重点实验室，生仪学院，杭州310027)

针对海洋水产品腹泻性毒素检测问题，设计了一种新型的基于细胞阻抗传感器(ECIS)的毒素快速检测分析系统。相对于传统的毒素检测方法，该系统具有操作简便，高一致性和高通量等特点。介绍了系统的硬件设计和软件设计，通过对系统整体性能测试以及使用神经母细胞瘤细胞(Neuro-2a)对腹泻性贝毒(DSP)大田软海绵酸(OA)进行毒性检测实验，用以验证系统平台的可行性。实验结果表明，基于细胞传感器的海洋水产品腹泻性毒性检测系统具备快速，长期，无损和高通量测量的特点，为腹泻性毒素检测提供了新的平台。

ECIS传感器;腹泻性贝类毒素;大田软海绵酸;毒素检测系统

TP216

A

1004－1699(2014)03－0283－06

2013-12-18修改日期:2014-02-21

C:7230J

10.3969/j.issn.1004－1699.2014.03.001

项目来源:海洋公益项目(201305010)