德夯嗜盐耐盐菌抗菌活性筛选和系统发育*

李洪军,肖建青,2,程金莲,刘 荷,钟小娟,易 旻,贺建武,刘祝祥,陈义光

(1.吉首大学生物资源与环境科学学院,湖南 吉首 416000;2.酒鬼酒股份有限公司,湖南 吉首 416000)

德夯嗜盐耐盐菌抗菌活性筛选和系统发育*

李洪军1,肖建青1,2,程金莲1,刘 荷1,钟小娟1,易 旻1,贺建武1,刘祝祥1,陈义光1

(1.吉首大学生物资源与环境科学学院,湖南 吉首 416000;2.酒鬼酒股份有限公司,湖南 吉首 416000)

以8个敏感菌株作为指示菌，采用琼脂扩散法，对分离自湖南省德夯峡谷(28°15′～28°43′ N,109°30′～109°45′ E)普通非盐环境土壤样品中的294株嗜盐及耐盐细菌进行抗菌活性筛选，并对其中具有较强抗菌活性的菌株进行基于16S rRNA基因序列的系统发育分析.受试菌株中有109株的发酵产物具有抗菌活性(阳性率37.1%)，其中5个菌株具有较强抗菌活性(JSM 102030，JSM 102052，JSM 102054，JSM 102066，JSM 102082).基于16S rRNA基因序列的系统发育分析表明，这5个菌株分别属于细菌域(Eubacteria)的3个门(Actinobacteria,Firmicutes,Proteobacteria)中的3个科(Bacillaceae,Halomonadaceae,Nocardiopsaceae)的4个属，菌株JSM 102030属于Halobacillus属，与该属已知种Halobacillus trueperi DSM 10404T的系统发育关系最为密切(序列相似性为99.1%)，JSM 102052和JSM 102054属于Halomonas属，与Halomonas alkaliphila 18bAGT的系统发育关系最为密切(序列相似性为98.3%)，JSM 102066属于Nocardiopsis属，与其系统发育关系最为密切的是Nocardiopsis prasina DSM43845T(序列相似性为99.3%)，JSM 102082与Oceanobacillus属的Oceanobacillus kimchii X50T以99.6%的16S rRNA基因序列相似性聚在一起.研究结果表明，分离自湖南省德夯峡谷普通非盐环境土样的嗜盐及耐盐细菌中存在较高比例的抗菌活性菌株，且这些细菌具有较为丰富的系统发育多样性.

普通非盐环境；嗜盐菌；耐盐菌；抗菌活性筛选；系统发育分析

极端微生物(Extremophile)是指那些在一般生物不能生存的条件下(如极酸极碱、极热极冷、高盐、高压等)能够生存的微生物[1].地球上存在着大量自然形成或者人工形成的盐域环境，如自然形成的死海等水环境和盐土环境，以及人工形成的如盐场、盐池、盐腌制食品等.自然界高盐环境的不同，其离子组成和盐浓度具有较大差异，这是由于形成过程和所处地质情况造成的.生活在这些高盐环境中的动植物种类较为有限，而以处于不同类群的微生物，如绿藻、嗜盐古菌和嗜盐及耐盐的细菌等为其主要生命形式[2].而嗜盐菌(Halophile)就是在海洋、盐湖、盐场以及腌制食品等高盐环境中生存的一种微生物[3].嗜盐及耐盐菌具有特殊的生理机制、奇特的环境适应模式以及独特的基因类型，使其不仅在存在的环境中对物质的自然转化发挥着重要作用，而且在高盐碱性污水处理过程中也表现出较大的应用前景，其分泌的相关酶类在工业中也有较为广泛的应用[2].嗜盐及耐盐菌的生物活性多样性及其物质化学结构的独特性，吸引人们利用该类微生物开发新型抗生素和新药前体物质[4].中国拥有广阔的盐环境和丰富的嗜盐耐盐微生物资源，近年来中国学者对这些微生物资源进行了研究，并筛选出一批具有较强生物活性的菌株[5-7].然而，Echigo A等[8]在日本东京周边地区的果园、草坪等普通非盐环境土壤中分离出176株能耐受20%(质量体积比)NaCl的芽胞杆菌科(Bacillaceae)嗜盐或耐盐细菌，并发现其中有15株代表潜在新类群(potential novel taxa).目前，国内对普通非盐环境土壤中的嗜盐及耐盐微生物的分离和抗菌活性筛选的研究鲜见报道.

湖南省吉首市德夯峡谷(28°15′～28°43′ N,109°30′～109°45′ E)地处湘西土家族苗族自治州首府吉首市境内，与凤凰、花垣、保靖3县交界，位于武陵山南支脉的南端，为云贵高原—江南丘陵的过渡地带.总面积252 km2，是湖南省著名的风景旅游区和国家地质公园[9-10].地质构造属中国东部新华夏系构造亚带的一部分，地貌属湘西北强烈上升侵溶蚀的中低山区南端，境内多陡坡峭壁，多条溪流穿梭于其间，呈半封闭式的“V”形峡谷，深达数百米，山原破碎，地形复杂，为典型的喀斯特岩溶峡谷景观.该地年均气温16～17 ℃，无霜期215～286 d，全年日照1 400 h左右，年降雨量1 200 ～1 600 mm，土壤多为石灰岩发育而成的山地黄壤，属于普通非盐环境土壤.因其独特的地理位置、地貌和复杂多样自然环境条件，境内孕育并保存了丰富的生物多样性[11].

笔者近年对该地区普通非盐环境土样中的嗜盐及耐盐微生物资源进行一系列的调查研究，发现其中可培养嗜盐及耐盐菌存在较为丰富的多样性.文中报道了对分离自德夯峡谷普通非盐环境土样中的嗜盐及耐盐细菌(含放线菌)的抗菌活性筛选结果，并对部分阳性菌株进行了基于16S rRNA基因序列的系统发育分析，以期为该类微生物资源的进一步开发利用提供实验依据.

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1 主要仪器和试剂 离心机购自德国Eppendorf公司(5810R)，显微镜购自Leica公司(DM 3000)，PCR仪购自BIO-RAD公司(PE-9600)；PCR引物由生工生物工程(上海)有限公司合成；其他试剂和仪器同文献[6].

1.1.2 主要培养基 (1)斜面培养基(Marine Agar 2216,MA)：蛋白胨5.0 g，酵母膏1.0 g，NaCl 19.45 g，MgCl25.9 g，Na2SO43.2 g，CaCl21.9 g，复合盐A液20 mL，复合盐B液1 mL，琼脂20.0 g，水1 L，pH值7.5～7.8.其中复合盐A液为柠檬酸铁5 g，KCl 27.5 g，Na2CO38 g，水1 L；复合盐B液为SrCl 34 g，KBr 80 g，H3BO322 g，Na2SiO34 g，(NH4)2SO41.6 g，Na2HPO48 g,水1 L.(2)液体种子培养基：葡萄糖15 g，蛋白胨10 g，牛肉膏2 g，甘露醇5 g,CaCO31 g，NaCl 20 g，其他成分同斜面培养基，pH值7.5～7.8.(3)液体(摇瓶)发酵培养基：蛋白胨5.0 g，酵母膏1.0 g，大豆粉5.0 g，葡萄糖20.0 g，NaCl 20.0 g，CaCO31.0 g，复合盐A液20 mL，复合盐B液1 mL，水1 L,pH值7.5～7.8.(4)营养琼脂培养基(Nutrient agar,NA):蛋白胨10.0 g,牛肉膏3.0 g,NaCl 5.0 g,琼脂15.0 g,水1 L,pH值7.2～7.5.

1.1.3 菌株来源 实验菌株共294株，是本室用添加5%～20% NaCl的Marine Agar 2216 (MA)等高盐培养基分离自德夯峡谷的森林、耕作区及溪流等非盐环境土壤.抗菌活性筛选用的8株敏感指示菌分别是革兰阳性菌(枯草芽胞杆菌(BacillussubtilisATCC 6051)、金黄色葡萄球菌(StaphylococcusaureusATCC 25922)、藤黄八叠球菌(SarcinaluteaGCMCC 1.880))、革兰阴性菌(大肠杆菌(EscherichiacoliATCC 128)、产气杆菌(EnterobacteraerogenesATCC 8724)、变形杆菌(ProteusvulgarisATCC 8427))、真菌(白色念珠菌(CandidaalbicansNCPC 1027)和黑曲霉(AsperillusnigerNCPC 1003)).

1.2方法

1.2.1 抗菌活性初筛 用5 mL发酵培养基洗下一支新鲜斜面菌体，接种于装有100 mL液体发酵培养基的500 mL三角锥形瓶中，28 ℃、150 r/min震荡培养96 h.发酵液5 000 r/min离心10 min，取上清液用标准的琼脂扩散法[12]测定其抗菌活性.重复3次，指示菌平板28 ℃培养48 h，记录抑菌结果.

1.2.2 抗菌活性复筛 用5 mL液体种子培养基洗下一支初筛抗菌活性阳性菌株新鲜斜面菌体，将菌体接种到装有50 mL液体种子培养基的250 mL三角锥形瓶中，28 ℃、150 r/min振荡培养48 h.取种子液10 mL(按10%接种量)接入装有90 mL液体发酵培养基的500 mL三角锥形瓶中，28 ℃、150 r/min振荡培养96 h.再按1.2.1所述方法进行抗菌活性实验.

1.2.3 基于16S rRNA基因序列的系统发育分析 按文献[13]中使用的方法对具有较强抗菌活性的菌株进行基因组DNA提取和16S rRNA基因扩增，寄给生工生物工程(上海)有限公司完成测序.扩增和测序使用1对细菌通用引物：正向引物8-27f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和反向引物1523-1504r(5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′).所得序列提交国际公共数据库GenBank保存并获得序列号，用EzTaxon-e[14]提供的数据库和在线软件进行序列相似性计算，并调出相似性较高的菌株的16S rRNA基因序列；使用CLUSTAL_X软件进行基因序列多重比对[15]，运用MEGA 4.0软件[16]采用邻接法(Neighbor-Joining方法)[17]进行聚类分析及构建系统进化树.重复取样1 000次进行自展值分析，以评估进化树的稳定性[18].

1.2.4 表型特征 分别采用不同质量体积比(0%，1%，3%，5%，7%，10%，15%，20%)NaCl的相应培养基平板测定实验菌株对盐的耐受性.菌落特征、细胞形态和生理生化特征按文献[19]的方法进行观察.

2 结果与分析

2.1抗菌活性筛选

2.1.1 初筛 对294株实验菌株进行抗菌活性初筛.统计发现，发酵液至少对1株指示菌有抗菌活性的菌株共有109株，阳性率37.1%，其中对黑曲霉(48株)和金黄色葡萄球菌(29株)具有较高抗菌活性(见表1).

表1 分离自德夯峡谷非盐土样的菌株抗菌活性筛选结果统计

2.1.2 复筛 对初筛得到的109株抗菌活性阳性菌株进行复筛.结果发现，有5株菌 (JSM 102030,JSM 102052,JSM 102054,JSM 102066,JSM 102082)发酵产物抗菌活性较强、抗菌谱较广(见表2).

表2 德夯峡谷非盐土样分离菌株抗菌活性复筛结果 /mm

注 “-”表示阴性.

2.2抗菌活性阳性菌株表型特征

对5株抗菌效果较好的菌株进行菌落特征、细胞显微形态结构和生理生化特征等观察(见表3).结果表明：5个株菌中3株为革兰氏阳性菌，2株为革兰氏阴性菌；这些菌株的NaCl耐受范围较广(在0%～15%内)，最适生长盐度范围为3%～7%(质量体积比)NaCl(见表3)，5株菌均为中度嗜盐菌[2].

表3 抗菌活性较强的5个株菌部分表型特征

注 “+”表示阳性；“-”表示阴性；“W”表示弱阳性；酪素和吐温-80水解均为阴性.

2.3基于16SrRNA基因序列的系统发育分析

对5个抗菌活性较强的菌株进行16S rRNA基因序列测定、相似性搜索、序列多重比对和进化树构建等系统发育分析.结果表明，这5个菌株类群多样性较高，分属于3个门(Actinobacteria,Firmicutes,Proteobacteria)中的3个科(Bacillaceae,Halomonadaceae,Nocardiopsaceae)的4个属.菌株JSM 102030属于Halobacillus属(Firmicutes门Bacillaceae科)，与该属已知种Halobacillus trueperi的典型菌株(Type strain)DSM 10404T的系统发育关系最为密切(序列相似性为99.1%)；JSM 102052和JSM 102054同属于Halomonas属(Proteobacteria门Halomonadaceae科)，与Halomonas alkaliphila 18bAGT的系统发育关系最为密切(序列相似性为98.3%)；JSM 102066属于Nocardiopsis属(Actinobacteria门Nocardiopsaceae科)，与其系统发育关系最为密切的是Nocardiopsis prasina DSM43845T(序列相似性为99.3%)；JSM 102082与Firmicutes门Bacillaceae科Oceanobacillus属的Oceanobacillus kimchii X50T以99.6%的16S rRNA基因聚在一起(见图1).

图1 基于16S rRNA基因序列的5株具有较强抗菌活性菌株的系统发育树

3 讨论

随着研究的不断深入，人们发现从普通环境中分离筛选新的活性物质产生菌的难度日益上升[7].目前，微生物及其活性物质的筛选急需扩大范围，即不仅要继续发掘特殊生境下土壤的微生物资源(例如沙漠及高原地带、高盐碱环境、温泉等)，还要分离和筛选植物内生菌，开发和应用海洋及极地微生物等资源，这是微生物研究的必然趋势[20-23].

文中研究结果表明，从湖南省吉首市德夯峡谷普通非盐环境土样中分离的294株菌中，有109株菌的发酵液具有对1种以上敏感指示菌有抗菌活性，其中5株菌株(JSM 102030,JSM 102052,JSM 102054,JSM 102066,JSM 102082)的发酵产物具较强的抗菌活性，其抗菌谱较广.系统发育分析结果表明，5株抗菌活性较强的菌株类群多样性较高，属于3个门(Actinobacteria,Firmicutes,Proteobacteria)中的3个科(Nocardiopsaceae,Bacillaceae,Halomonadaceae)的4个属(Nocardiopsis,Halobacillus,Oceanobacillus,Halomonas).本研究的结果说明，从德夯峡谷普通非盐环境土样中分离得到的的嗜盐和耐盐细菌具有较高比例能产生抗菌活性物质的菌株，有一定的开发潜力.笔者前期研究[24-25]和本研究的结果都说明，从普通非盐环境土样中的耐盐和嗜盐微生物中筛选抗菌活性菌株是发现抗菌物质产生菌的途径之一.

[1] 方金瑞,黄维真.海洋极端微生物的分离及其开发研究(Ⅰ)—— 嗜碱、嗜冷微生物的分离及其产生的活性物质[J].中国海洋药物,1996(1):5-10.

[2] 任培根,周培瑾.中度嗜盐菌的研究进展[J].微生物学报,2003,43(3):427-431.

[3] 冯二梅,宿红艳,王 磊.中度嗜盐菌的研究进展[J].安徽农业科学,2009,37(31):15 125-15 126；15 190.

[4] 赵百锁,杨礼富,宋 蕾,等.中度嗜盐菌在生物技术中的应用[J].微生物学通报,2007,34(2):359-362.

[5] 陈义光,姜 怡,崔晓龙,等.具抗肿瘤活性中度嗜盐菌YIM 80186的分离和系统发育分析[J].云南大学学报:自然科学版,2006,28(5):444-449.

[6] 陈义光,李文均,崔晓龙,等.具抗肿瘤活性放线菌菌株YIM 90022的分离和系统发育分析[J].微生物学报,2006,46(5):696-701.

[7] 朱泓溢,肖建青,刘祝祥,等.栉江珧相关细菌抗菌活性筛选及系统发育分析[J].微生物学杂志,2013,33(2):7-12.

[8] ECHIGO A,HINO M,FUKUSHIMA T,et al.Endospores of Halophilic Bacteria of the Family Bacillaceae Isolated from Non-Saline Japanese Soil May be Transported by Kosa Event (Asian Dust Storm)[J].Saline Systems,2005(1):1-13.

[9] 陈功锡,邓 涛,张代贵,等.湖南德夯峡谷峡谷特殊生境植物区系与生态适应性初探[J].西北植物学报,2009,29(7):1 470-1 478.

[10] 张佑祥,张良军,刘志霄,等.湖南德夯峡谷蝶类资源调查及区系分析[J].安徽农业科学,2009,37(23):11 029-11 031.

[11] 陈功锡.德夯峡谷植物区系的研究(Ⅰ)植物区系组成分析[J].吉首大学学报：自然科学版,1994,15(6):74-79.

[12] 胡昌勤,刘 炜.抗生素微生物检定法及其标准操作[M].北京:气象出版社,2004．

[13] CUI Xiaolong,MAO Pinghua,ZENG Mei.StreptimonosporaSalinaGen.Nov.,Sp.Nov.,a New Member of the Family Nocardiopsaceae[J].International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,2001,51(2):357-363.

[14] KIM O S,CHO Y J,LEE K,et al.Introducing EzTaxon-e:A Prokaryotic 16S rRNA Gene Sequence Database with Phylotypes That Represent Uncultured Species[J].International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,2012,62(3):716-721.

[15] JULIE D T,TOBY J G,FRÉDÉRIC P,et al.The CLUSTAL_X Windows Interface:Flexible Strategies for Multiple Sequence Alignment Aided by Quality Analysis Tools[J].Nucleic Acids Research,1997,25(24):4 876-4 882.

[16] KOICHIRO T,JOEL D,MASATOSHI N,et al.MEGA4:Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) Software Version 4.0[J].Molecular Biology and Evolution,2007,24(8):1 596-1 599.

[17] SAITOU N,NEI M.The Neighbor-Joining Method:A New Method for Reconstructing Hylogenetic Trees[J].Molecular Biology and Evolution,1987,4(4):406-425.

[18] FELSENSTEIN J.Confidence Limits on Phylogenies:An Approach Using the Bootstrap[J].Evolution,1985,39(4):783-791.

[19] 东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京:科学出版社,2001:364-398.

[20] KUSHNER D J.The Halobacteriaceae [M]//SOKATCH J R,ORNSTON L N,Ed.The Bacteria,a Treatise on Structure and Function,Vol Ⅷ.San Diego:Academic Press,1985:171-206.

[21] 赵永坤,于化泓,杨 萌.微生物生物活性物质开发应用进展[J].江西食品工业,2007(4):37-40.

[22] 朱宝泉.生物制药技术[M].北京:化学工业出版社，2004.

[23] 程元荣,郑 卫.微生物生物活性物质的研究进展[J].中国抗生素杂志,2002,27(10):632-640.

[24] 陈奇辉,刘祝祥,彭清忠,等.小溪自然保护区非盐环境土壤中嗜盐和耐盐菌多样性[J].微生物学报,2010,50(11):1 452-1 459.

[25] 陈奇辉,张 丽,刘祝祥,等.小溪自然保护区嗜盐及耐盐菌抗菌活性筛选及生物学特征[J].微生物学杂志,2010,30(1):7-12.

(责任编辑 陈炳权)

ScreeningandPhylogeneticAnalysisofAntibiotic-ProducingHalophilicandHalotolerantBacteriafromtheDehangCanyoninHunanChina

LI Hongjun1,XIAO Jianqing1,2,CHENG Jinlian1,LIU He1,ZHONG Xiaojuan1,YI Min1,HE Jianwu1,LIU Zhuxiang1,CHEN Yiguang1

(1.College of Biology and Environmental Sciences,Jishou University,Jishou 416000,Hunan China;2.Jiugui Liquor Co.Ltd.,Jishou 416000,Huana China)

The antimicrobial activity of the fermentation brothes of 294 halophilic and halotolerant bacteria,isolated from ordinary non-saline soils collected from the Dehang Canyon (28°15′～28°43′ N,109°30′～109°45′ E) in Hunan Province,China,was screened using the agar diffusion method employing 8 indicator microorganisms (three Gram-positive bacteria,three Gram-negative bacteria and two fungi).The results showed that,out of 294 strains tested,109 were positive in antimicrobial activity (37.1%),in which 5 strains exhibited strong antimicrobial activity.Then these 5 strains were submitted for 16S rRNA gene amplification and phylogenetic analysis after phenotypic characterization including morphological,biochemical and physiological tests.The results suggested that these 5 strains were members of 4 genera in 3 families (Bacillaceae,Halomonadaceae,Nocardiopsaceae) of 3 phyla (Actinobacteria,Firmicutes,Proteobacteria):strain JSM 102030 belonged to the genusHalobacillus(Firmicutes,Bacillaceae),being most closely to the type strain of Halobacillus trueperi (sequence similarity 99.1%);strains 102052 and JSM 102054 were members of the genusHalomonas(Proteobacteria,Halomonadaceae),being related most closely to the type strain of Halomonas alkaliphila (98.3%);strains JSM 102066 strain JSM 2155017 belonged to the genusNocardiopsis(Actinobacteria,Nocardiopsaceae),exhibiting 99.3 % 16S rRNA gene sequence similarity to Nocardiopsis prasina DSM43845T;strain JSM 102082 belonged to the genusOceanobacillus(Firmicutes,Bacillaceae),exhibiting 99.6% 16S rRNA gene sequence similarity to Oceanobacillus kimchii X50T.

ordinary non-saline environment;halophilic bacteria;halotolerant bacteria;antimicrobial activity;phylogenetic analysis

1007-2985(2014)06-0073-05

2014-07-25

国家自然科学基金资助项目(31460004，30970007)；湖南省重点学科建设资助项目(JSU071312Z01)；湖南省高校科技创新团队支持计划(201208Z01)

李洪军(1978—)，男，湖南涟源人，吉首大学生物资源与环境科学学院硕士生，主要从事微生物资源与生态研究

陈义光(1965—)，男，湖南新化人，吉首大学生物资源与环境科学学院教授，硕士生导师，主要从事微生物资源与生态研究.

Q9393.92

B

10.3969/j.issn.1007-2985.2014.06.018