威宁黄牛CIS基因启动子区SNP及其与生长性状相关研究

蒋会梅，张义玲，张贵祥，袁 军，杨永强，刘若余*

(1.贵州毕节地区畜牧技术推广站，贵州 毕节 551700；2.贵州大学 动物科学学院，高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，贵州贵阳 550025)

科学研究

威宁黄牛CIS基因启动子区SNP及其与生长性状相关研究

蒋会梅1，张义玲1，张贵祥1，袁 军1，杨永强2，刘若余2*

(1.贵州毕节地区畜牧技术推广站，贵州 毕节 551700；2.贵州大学 动物科学学院，高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，贵州贵阳 550025)

为研究CIS基因启动子区SNP与黄牛生长相关性状关联性，选择106头威宁黄牛作为研究对象，利用PCR-SSCP分析CIS基因启动子区SNP与不同个体生长相关性状的相关性。结果表明：A-726G位点在威宁黄牛中有不同分型，母畜群体中，该SNP位点与体直长、胸围、胸宽、腰高、坐骨端宽有显著关联(P<0.05)，其中对胸宽的影响达到极显著水平(P<0.01)，AA型个体多项性状均值均最高；在公畜群体中，A-726G位点与胸宽有显著关联，A-726G可能作为影响黄牛生长性状的重要功能性SNP，研究结果为进一步阐明CIS基因功能奠定试验基础。

CIS；SNP；启动子；威宁黄牛

细胞因子信号传导抑制子(SOCS)家族对生长激素(GH)在内的细胞因子或生长因子信号通路起负调控作用[1-3]。包括CIS和SOCS1-7共8个成员，CIS蛋白包含C端的SH2结构域、SOCS box和N端结构域。CIS蛋白可抑制GH诱导的JAK2、GHR、STAT5a和STAT5b磷酸化作用而减弱GH信号级联反应[4]，但首先需要引起GHR胞质内在化(internalization)[5]，而高浓度GH导致CIS基因表达水平瞬时上升[6]。CIS蛋白还可通过直接与GHR酪氨酸磷酸化残基结合抑制GH信号途径[7]。基因启动子变异影响基因表达水平。目前对于牛CIS基因启动子多态性研究极少，杨永强等[8]在贵州务川黑牛、贵州荷斯坦奶牛CIS基因启动子区筛查到3个SNP位点。贵州地方黄牛品种存在生长速度慢，体型较小等问题，提高贵州黄牛生长性能是今后贵州黄牛品种选育的主要任务。本试验为进一步研究CIS基因启动子区SNP功能，选择贵州地方优良黄牛品种威宁黄牛为研究对象，针对上述3个SNP位点研究其与威宁黄牛生长相关性状间关联性，为筛选影响黄牛生产性能的分子标记奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

106头威宁黄牛血样采自贵州省威宁县，均为成年牛，其中公畜51只，母畜55只，按相应标准测定个体体高、体斜长、体直长、胸围、管围、胸深、胸宽、腰高和坐骨端宽共9个生长相关性状指标。利用生工生物公司的血液基因组提取试剂盒提取牛DNA，1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取效果，每个DNA样品浓度使用紫外分光光度计测量3次，取平均值。

1.2 引物设计和DNA扩增

根据牛CIS基因(GenBank登录号：AC_000179.1)DNA序列，利用Primer-BLAST软件设计2对特异性引物，引物信息见表1。PCR反应体系为15 μL：上、下游引物(浓度为10 pmol/μL)各0.75 μL，2×Taq PCR Master Mix试剂7.5 μL，模板DNA 1 μL，三蒸水5 μL。采用Bio-Rad公司PCR扩增仪进行DNA扩增，PCR扩增条件：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，最佳温度退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环，72 ℃延伸10 min。1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，凝胶成像系统观察电泳结果。

表1 引物序列、退火温度及目的片段长度Table 1 Sequences of primer,annealing temperature and predicted length of amplified DNA

1.3 基因分型和数据统计

扩增出特异性PCR产物后，利用PCR-SSCP方法对所有个体进行基因型检测，SSCP条件为：PCR产物与变性剂按1∶1比例混合，100 ℃水浴变性10 min，迅速放置于-20 ℃冰箱15 min，利用10%聚丙烯酰胺凝胶电泳在200V电压下运行8 h，银染法进行染色、显色。挑选不同基因型个体进行DNA测序确定不同基因型。EXCEL软件计算等位基因频率、基因型频率等，考虑性别因素，利用SPSS软件建立一般线性模型，进行SNP与生长性状间关联性分析。

2 结果与分析

2.1 PCR产物检测

针对3个SNP位点设计2对特异性引物进行PCR扩增，分别为292 bp和379 bp，从图1可看出,扩增条带单一、明亮，扩增产物为目标序列，说明引物特异性好，可用于后续SSCP分型研究。

图1 威宁黄牛CIS基因不同引物DNA扩增结果Fig.1 Results of DNA amplification of CIS in Weining Cattle

2.2 基因分型及测序验证

利用106个威宁黄牛个体进行PCR-SSCP研究，结果见图2。由图2知，CIS-1引物扩增产物具有三种基因型，分别命名为GG、GA、AA，而CIS-2引物扩增产物未发现不同基因型，可能威宁黄牛个体中-85 bp位点不具有多态性特征。挑选不同基因型个体进行DNA测序，利用DNAStar软件对测序结果进行分析，测序峰图见图3。

图2 CIS基因启动子区PCR扩增产物SSCP检测结果A.CIS-1引物SSCP检测；B.CIS-2引物SSCP检测Fig.2 SSCP results of PCR production in CIS promoter regionA.represented CIS-1;B.represented CIS-2

由表2可知，A-726G位点在公畜、母畜群体中G等位基因均为优势基因，频率分别为0.5295、0.6000，公畜中GG、AG基因型频率接近，AA基因型频率最低，而母畜中AA、AG基因型频率接近，AA基因型频率同样为最低，均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，表明威宁黄牛A-726G位点的基因型频率没有受到选择、突变或迁移等因素影响。随后建立一般线性模型进行SNP位点与9个体尺性状间关联性分析，结果见表3。在母畜中，A-726G位点对体直长、胸围、胸宽、腰高、坐骨端宽的影响达到显著水平(P<0.05)，对胸宽达到极显著水平(P<0.01)，AA型个体具有更出色的体直长、胸围、胸宽、腰高、坐骨端宽性状，而在公畜中，A-726G位点仅对胸宽的影响达到显著水平，AA型个体胸宽均值最高，而SNP对其他性状无显著性关联。结果表明A-726G对威宁黄牛体尺性状有重要影响。

图3 CIS基因G-726A位点不同基因型个体测序结果Fig.3 Sequencing of various genotypes in G-726A of CIS gene

表2 A-726G在威宁黄牛群体中等位基因和基因型频率Table 2 Allele and genotype frequencies at A-726G locus in Weining Cattle

注：括号中数字为个体数。

Notes:data in brackets are individual numbers.

表3 CIS基因中A-726G与威宁黄牛体尺性状的关联性分析Table 3 Association analysis of A-726G SNP genotypes with body measurement traits at Weining Cattle CIS gene

注：同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.01)，肩标大写字母不同表示差异极显著(P<0.01)。

Notes:In the same wlumn,datm with different superscripts lowercase letters indicate significant difference(P<0.05),with different superseripts uppercase letters irdicate highly sighificant different(P<0.01).

3 讨 论

CIS基因能被GH等多种细胞因子或生长因子激活[9-10]。GH首先诱导细胞膜受体GHR二聚体化，进而激活STAT蛋白形成二聚体进入核内作为转录因子诱导下游基因表达[11]，CIS蛋白通过抑制STAT蛋白与下游蛋白的结合而减弱GH信号通路。CIS蛋白一条途径通过与STAT5B竞争GHR酪氨酸磷酸化位点而部分抑制GH通路，另一条途径介导蛋白酶体降解进行时间依赖性抑制[12]。

CIS蛋白在GH信号通路中具有重要调控作用，其遗传变异可能影响哺乳动物GH功能发挥，牛CIS基因mRNA长度为1 952 bp，共有3个外显子，编码254个氨基酸，本试验首次研究CIS基因5'调控区SNP与黄牛生长性状间关联性。威宁黄牛主要分布于贵州西部高寒山区，属小型役肉兼用型品种，具有耐寒、耐粗饲、遗传性能稳定等优良特性[13]。威宁黄牛肉质鲜美，蛋白质含量高，脂肪含量适中，矿物质营养丰富[14]，但其生长性能需要进一步改良提高。本研究发现在威宁黄牛母畜中，A-726G与体直长、胸围、胸宽、腰高、坐骨端宽有显著关联，AA型个体多项生长性能指标均最高，公畜群体中也与胸宽有显著关联,CIS基因是否与哺乳动物性腺激素分泌有关需深入探究。本研究首次证实了CIS基因多态性与贵州黄牛生长性状有关联，A-726G突变可能是重要的功能突变位点，这一结论对肉牛选种选育具有重要意义，对CIS基因SNP研究结果为进一步分析CIS启动子功能和阐明CIS蛋白对黄牛生长所起作用奠定基础。

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AssociationofPolymorphisminPromoterRegionofCISgenewithGrowthTraitsinWeiningCattle

JIANG Hui-mei1,ZHANG Yi-ling1,ZHANG Gui-xiang1,YUAN Jun1,YANG Yong-qiang2,LIU Ruo-yu2*

(1.BijieAnimalScienceandTechnologyExtensionStation,BijieGuizhou,551700;2.CollegeofAnimalSciences,GuizhouUniversity/KeyLaboratoryofAnimalGenetics,BreedingandReproductioninthePlateauMountainousRegion,MinistryofEducation,GuiyangGuizhou,550025,China;)

In order to study the correlation between the SNP in the promoter region of CIS gene and growth traits in cattle,a total of 106 Weining cattle were selected in this study.PCR-SSCP and DNA sequencing methods were used to analyse the association between SNP and specific growth traits.Results showed that various genotypes existed in different animals for the SNP of A-726G.For the female cattle populations,A-726G had significant effects on body length,heart girth,chest width,hip height and hucklebone width,with a highly significant effect on chest width,and the individuals with AA genotype had significantly higher mean value for those traits.Additionally,for the male cattle populations,A-726G had significant effect on chest width (P<0.05).It indicated that A-726G is an important functional SNP site that affect the cattle growth performance.This could lay an experimental foundation for the identification of function of CIS gene in cattle.

CIS; SNP; promoter; Weining cattle

2014-01-24，

2014-03-24

贵州省重大科技专项计划项目(黔科合重大专项字[2011]6009号)

蒋会梅(1963-)，女，贵州人，高级畜牧师，本科，研究方向：动物遗传育种。E-mail:jhm9088@163.com

*[通讯作者]刘若余(1963-)，男，湖南邵东人，教授，硕士研究生导师，博士，研究方向：分子遗传与动物育种。 E-mail：liury04@163.com

S811.6

A

1005-5228(2014)07-0013-04