异甘草素对创伤性脑损伤大鼠神经保护作用的实验研究

杨永明，荔志云

(兰州军区兰州总医院 神经外科，甘肃 兰州，730050)

近年来交通事故和地震等自然灾害引起的创伤性脑损伤(TBI)呈上升趋势。脑创伤后，损伤灶部位脑组织产生大量的自由基和炎症介质引起神经元水肿和坏死是导致继发性脑损伤的一个重要原因。中药干草的提取物异甘草(ISL)具有较为广泛的药理活性，其在神经损伤修复方面有多种作用[1]，本实验通过异ISL对创伤性脑损伤的大鼠进行干预探讨其治疗机制。

1 资料与方法

1.1 实验动物、试剂及仪器

SPF级Wistar 雄性大鼠45只，由兰州军区兰州总医院动物实验科提供，鼠龄2～3个月，体质量150～200 g，异甘草素(纯度98%)(上海源叶生物科技公司提供)，SOD和MDA检测试剂盒(南京建成试剂公司)，IL-6 TNF-α检测试剂盒(上海丰翔生物科技有限公司)，超低温冰箱(日本三洋公司)，低速离心机(北京医用离心机公司)，直接读数分析天平(日本岛津公司)，全自动酶标仪(中国南京华东电子厂)，分光光度计(上海天美科学仪器厂)，恒温水浴箱(上海乔枫实业公司)，显微镜(日本OLYMPUS公司)。

1.2 脑外伤模型制作

参照Feeney法[2]，自制打击器，由撞杆、下落打击棒和金属套管3部分组成。打击棒重30 g，下落高度30 cm，直径3 mm，打击深度为3 mm。大鼠用10%水合氯醛(30 mg/kg，腹腔注射)麻醉后，固定头部，消毒后于矢状正中线切开头皮，分离软组织及骨膜，用小型电钻在左顶叶上方开直径约4 mm的骨窗，并保持硬膜完整。保持硬脑膜的完整。将打击装置垂直固定于大鼠的脑表面，打击棒沿金属套管从30 cm高度打击大鼠头部致伤(冲击力为900帕斯卡)造成左侧大脑半球局部脑挫裂伤损伤。充分止血后，予以碘附清洗伤口并缝合头皮，假手术组仅开骨窗不打击。大鼠出现短暂的四肢抽搐，呼吸暂停为造模成功。

1.3 动物分组及给药

随机数字表法分为假手术组、脑外伤组、异甘草素组，每组15只。依据预实验时得到的最佳异甘草素浓度，术后2 h添加异甘草素组给予异甘草素30 mg/kg腹腔注射治疗1次/d，脑外伤组和假手术组等量的腹腔注射治1次/d，共治疗5 d。

1.4 干湿比重法脑含水量检测

实验动物于TBI后第5天，各组任取5只大鼠每只经10%水合氯醛2 mL腹腔注射过量麻醉后断头处死，取大鼠损伤侧脑组织体积约0.5 mL，去除凝血，用冰冷生理盐水冲洗脑组织表面血迹，滤纸吸去脑组织表面残余水分，用电子天平测其湿重，然后于60 ℃通风烘烤箱烘烤96 h，取出称干重，计算含水量：脑水含量=(湿重-干重)/湿重×100%。

1.5 脑组织SOD及MDA含量、TNF-α和IL-6的检测。

实验动物于TBI后第5天，各组随机取5只大鼠，每只经10%水合氯醛2 mL腹腔注射过量麻醉后迅速断头取脑， 用冰冷生理盐水冲洗脑组织表面血迹，滤纸吸去脑组织表面残余水分，取受打击部位脑组织约0.2 mL用电子天平测其重量后加入9倍体积的PBS缓冲液制作损伤大脑皮层匀浆，离心后提取上清液按照说明书步骤进行脑组织匀浆液SOD及MDA，IL-6和TNF-α检测。

1.6 病理切片观察脑皮层及损伤灶组织形态变化

实验动物于TBI后第5天，各组随机取5只大鼠，每只经10%水合氯醛2 mL腹腔注射过量麻醉后切开胸腔，经左心室用生理盐水冲至上腔静脉流出液体清亮后再用4%的多聚甲醛冲洗3次，内固定后取脑用冷生理盐水冲洗脑组织表面血迹，滤纸吸去脑组织表面残余水分，浸入4%多聚甲醛固定48 h，石蜡包埋，以损伤灶中心制作脑组织矢状位切片片厚3 μm，HE染色显微镜放大50倍观察脑皮层及损伤灶组织形态学病理变化。

1.7 统计学处理

采用SSPS 17.0统计软件分析，计量资料以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 脑组织含水量、SOD、MDA、IL-6、TNF-α检测结果

在TBI后第7天，脑外伤组大鼠脑组织水含量显著高于假手术组，SOD含量显著低于假手术组，MDA含量显著高于假手术组、IL-6含量显著高于假手术组，TNF-α含量显著高于假手术组(P<0.01)，SOD活性均显著低于A组(P<0.01); 异甘草素组脑组织含水量低于脑外伤组、异甘草素组脑组织SOD含量高于脑外伤组，MDA含量显著低于脑外伤组，IL-6含量显著低于脑外伤组，TNF-α含量显著高于脑外伤组(P<0.01)。见表1。

表1 异甘草素对脑外伤大鼠脑组织含水量和细胞因子及氧化应激指标的影响

2.2 脑皮层组织形态学观察

A组脑皮层细胞均匀分布，细胞密集，软脑膜连续且完整；B组脑皮层打击灶形成以脑软化灶，创面凹陷，细胞数目明显稀疏，半透明水肿带超出损伤灶延伸至海马，软脑膜膜缺损；C组脑皮层损伤灶细胞数明显增多，伤口已被肉芽组织填平，软脑膜已经形成，并与正常脑组织入脑膜相续，半透明水肿带较B组窄，水肿带主要局限在损伤灶底部。见图1。

3 讨 论

脑损伤后氧化应激是加重继发性脑损伤的重要机制，脑组织损伤后活性氧如超氧阴离子自由基(O2-)，过氧亚硝基阴离子，羟基自由基可导致组织破坏和细胞死亡。氧化应激可以使细胞直接死亡，还可成诱导凋亡程序启动，加重脑损伤。Smith J等[3]报道创伤性脑损伤，创伤性脊髓损伤和缺血性脑损伤均可引起氧化应激反应，产生脂质过氧化，蛋白质氧化等，并可以损伤DNA，导致神经细胞死亡。SOD能催化超氧化物歧化成氧和过氧化氢，MDA是脂质氧化产物，二者成负相关，联合检测可以准确地反映组织氧化应激反应水平，可以衡量药物抗氧化应激的有效性[4]。脑水肿是创伤性颅脑损伤一个重要的病理机制，是颅内压增高的主要原因[5]。创伤性脑损伤后，血管壁破坏，血液进入组织间隙，引起血管性脑水肿，损伤区血供减少细胞缺血引起细胞钠钾泵转运障碍，细胞内钠离子聚集导致细胞水肿，颅内特殊结构系统的损伤可引起脑脊液回流障碍导致脑积水，以上因素均可使颅内压升高，对生命造成巨大威胁。创伤性脑损伤后小胶质细胞和星形胶质细胞的激活早期TNF-α等细胞炎症因子便有升高[6]。Herz J等[7]报道IL-6和TNF-α水平增高可引起炎性细胞聚集，血管通透性增高，加重脑组织损伤。Laird MD等[8]研究显示小胶质细胞过多表达IL-6可促进星形胶质细胞水通道蛋白AQP4表达加重脑水肿。

本实验发现TBI大鼠经异甘草治疗5 d后，ISL治疗组脑水肿较脑外伤组明显减轻。脑皮层病理切片放大50观察异甘草素治疗组损伤灶周围水肿带明显小于脑外伤组，损伤灶肉芽组织增生明显多于脑外伤组。ISL组损伤灶已经被肉芽组织完全充填，软脑膜已经形成并且大鼠前爪肌力改善。实验中可见ISL组SOD活性明显高于脑外伤组，ISL组脑组织MDA含量、IL-6和TNF-α含量、脑组织含水量低于脑外伤组，ISL组病理组织形态学观察好于脑外伤组。中药甘草的提取物异甘草素具有多中药理活性。大量文献[9]报道，异甘草素有较强的抗氧化活性以减少活性氧的产生，降低CASPAS-3的表达，提高组织BACL-2的表达 减低Ca离子聚集，保护脑皮层细胞，防治神经退行性疾病。异甘草素通过改善脑的能量代谢，抗氧化的作用保护缺血再灌注损伤后的脑组织[10]。异甘草素具抗脂质过氧化[11]、有松弛血管[12]、抑制血小板聚集、抗病毒、抗肿瘤[13]及雌激素样活性[14]、抗细胞凋亡[15-16]等多种药理作用。Jeon JP等[17]研究发现ISL可以通过调节蛋白质代谢，信号转导，蛋白质折叠和运输，氧化应激，降低可卡因诱导的神经元毒性作用保护脑组织。Zhan C等[18]研究发现异甘草素可以通过增加ATP的储备，改善脑组织能量代谢，保护对小鼠局灶性缺血的脑组织。杨永明、荔志云[19-20]报道异甘草素可以通过调节细胞因子促进TBI大鼠康复。本实验发现异甘草具有上调脑组织SOD的活性、减少MDA的生成、降低IL-6和TNF-α的含量，减轻脑水肿，改善大鼠前爪肌力，促进脑组织创面的愈合，对TBI大鼠具有显著地神经保护作用，其在脑组织其他方面的作用值得进一步研究。

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