ADAM9特异性siRNA对肾透明细胞癌786-0细胞ADAM9基因表达及体外侵袭能力的影响

张新恒，马曜辉，单中杰

1)新乡医学院研究生处 新乡 473003 2)郑州人民医院泌尿外科 郑州 450003

ADAM9特异性siRNA对肾透明细胞癌786-0细胞ADAM9基因表达及体外侵袭能力的影响

张新恒1)，马曜辉1)，单中杰2)#

1)新乡医学院研究生处 新乡 473003 2)郑州人民医院泌尿外科 郑州 450003

#通讯作者，男，1964年12月生，博士，教授，研究方向：尿路疾病，E-mail：shanzhongjie@vip.sina.com

肾透明细胞癌；去整合素金属蛋白酶9；侵袭

目的：探讨去整合素金属蛋白酶9(ADAM9)特异性siRNA对人肾透明细胞癌(RCCC)786-0细胞中ADAM9基因表达及体外侵袭能力的影响。方法设计合成ADAM9特异性siRNA。将786-0细胞分4组处理，分别为正常对照组(正常培养786-0细胞)、空脂质体转染组、阴性转染组(转染无义 siRNA)和ADAM9 siRNA转染组。转染24、48、72 h后，采用RT-PCR法检测细胞ADAM9 mRNA的表达；转染48 h后，采用Western blot法检测细胞ADAM9蛋白的表达， 并用Transwell法检测细胞侵袭能力。结果转染24、48、72 h后，ADAM9 siRNA转染组786-0细胞ADAM9 mRNA的表达显著低于其他3组(F=47.945、180.456、60.978，P均<0.001)；转染48 h后，ADAM9 siRNA转染组786-0细胞ADAM9蛋白表达显著降低(F=142.816，P<0.001)，穿膜细胞数显著减少(F=45.389，P<0.001)。结论ADAM9特异性siRNA能够有效沉默786-0细胞中ADAM9的表达并降低其体外侵袭能力。

RNA干扰(RNA interference, RNAi)是在mRNA水平上沉默基因表达的过程，目前RNAi已成为研究基因功能的一种重要的实验方法[1]。肾透明细胞癌(renal clear cell carcinoma，RCCC)是最常见的成年人肾脏恶性肿瘤，由于癌细胞可表达多种耐药蛋白,因此对常规化疗不敏感，对放疗也不敏感。对于晚期肾癌或转移癌，近年的分子靶向治疗虽取得了一定的成绩，但总体上存在着完全缓解率低、有一定副作用、个体差异显著等问题[2]。去整合素金属蛋白酶9(a disintegrin and metalloprotease 9，ADAM9)是去整合素金属蛋白酶家族成员之一，在RCCC组织中高表达并与患者的肿瘤进展及不良预后相关[3]，但其促进肿瘤进展的具体机制尚不明确。作者采用RNAi、RT-PCR、Western blot、Transwell等方法探讨了ADAM9特异性siRNA对人RCCC 786-0细胞中ADAM9基因的表达及侵袭能力的影响。

1 材料与方法

1.1主要实验材料786-0细胞及专用培养基购自武汉博士德生物工程有限公司。ADAM9特异性siRNA ADAM9-siRNA-2366：正义链5’-CCAGAGA AGUUCCUAUAUA-3’，反义链5’-UAUAUAGGAAC UUCUCUGG-3’； 无义siRNA(NC siRNA)：正义链5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’ ，反义链5’-AAA CGUGACACACGUUCGGAGAA-3’。上述siRNA均由美国百奇公司设计合成。转染试剂LipofectamineTM2000及低血清培养基购自美国Invitrogen公司。ADAM9引物(上游 5’-CATTGAGGGAGGGACTTCT GGT-3’，下游5’-ATGGGAACTGCTGAGGTTGCTT-3’，产物大小282 bp)由上海捷瑞生物工程有限公司设计合成。β-actin引物(上游5’-TGACGTGGACATC CGCAAAG-3’，下游5’-CTGGAAGGTGGACAGCGAG G-3’，产物大小205 bp)由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。兔抗人ADAM9抗体购自美国百奇公司。抗β-actin兔多克隆抗体、RNA提取试剂盒、HiFi-MMLV cDNA第一链合成试剂盒、2×Taq MasterMix、哺乳动物蛋白提取试剂盒、蛋白定量试剂盒、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司。超敏ECL化学发光试剂盒BeyoECL Plus购自碧云天生物技术研究所。孔径8 μm Transwell培养板购自康宁公司。基质胶购自BD Biosciences公司。

1.2实验分组实验分为4组。正常对照组：正常培养786-0细胞，不做处理。空脂质体转染组：以体积分数0.2%的LipofectamineTM2000处理786-0细胞。阴性转染组：用体积分数0.2%的LipofectamineTM2000及80 nmol/L的NC siRNA处理细胞。ADAM9 siRNA转染组：用体积分数0.2%的LipofectamineTM2000及80 nmol/L的ADAM9-siRNA-2366处理细胞。

1.3细胞中ADAM9mRNA的检测转染24、48、72 h后收集各组细胞，提取细胞总RNA，反转录为cDNA，然后进行PCR。PCR条件：94 ℃预变性 2 min;94 ℃变性30 s,59 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共30个循环;72 ℃终延伸2 min，4 ℃保存。以β-actin为内参。产物经30 g/L琼脂糖凝胶电泳，EB染胶，用凝胶成像仪拍照，用ImageJ软件对图片进行数据分析。以ADAM9与β-actin条带灰度值的比值表示ADAM9 mRNA的表达水平[4]。实验重复3次。

1.4细胞中ADAM9蛋白的检测各组细胞转染48 h后，吸掉培养基，按哺乳动物蛋白提取试剂盒说明提取细胞总蛋白，按蛋白定量试剂盒Bradford比色法绘制蛋白定量标准曲线并测定蛋白质浓度。按SDS-PAGE凝胶制备试剂盒操作步骤配制SDS-PAGE凝胶。每孔上样60 μg，浓缩胶80 V、分离胶120 V电泳约30 min。切胶,转膜1～2 h,TBST洗膜，50 g/L脱脂奶粉封闭，一抗(ADAM9兔多克隆抗体稀释100倍，内参β-actin抗体稀释1 000倍)孵育过夜。TBST洗膜15 min×3次，HRP(抗兔)10 mL孵育4 h，漂洗3～5次，每次3 min。将超敏ECL化学发光试剂盒中A液、B液各0.5 mL混匀，暗环境下加到PVDF膜上，凝胶成像仪拍照，用Image J软件对图片进行数据分析。以ADAM9与β-actin条带灰度值的比值表示ADAM9蛋白的表达水平[4]。实验重复3次。

1.5细胞侵袭能力的测定各组细胞转染48 h后，收集并计数，调整细胞密度均等。冰上融化基质胶，包被Transwell内室的基底膜。每组细胞设3个复孔。下室内为含体积分数10%胎牛血清的培养基，上室内为200 μL含低血清培养基的浓度相同的细胞悬液。孵育12 h后取出,擦去内表面的基质胶及未穿膜的细胞，多聚甲醛固定，苏木素伊红染色,镜下观察拍照, 每孔取3个视野(100倍)分别计数穿膜细胞数，取平均值，用穿膜细胞数代表细胞的侵袭能力[4]。

1.6统计学处理数据用SPSS 17.0处理，4组间ADAM9 mRNA、蛋白表达水平及穿膜细胞数的比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 4组细胞ADAM9mRNA的表达见图1及表1。ADAM9 siRNA转染组细胞转染24、48、72 h后，细胞中ADAM9 mRNA表达均明显降低，以转染48 h的沉默效果最好。

图1 4组细胞ADAM9 mRNA的表达

1:DNA Marker；2:正常对照组；3:空脂质体转染组；4:阴性转染组；5、6:ADAM9 siRNA转染组。

表1 4组细胞ADAM9 mRNA的表达

*：与其他3组比较，P<0.01。

2.2 4组细胞ADAM9蛋白的表达见图2和表2。

图2 4组细胞ADAM9蛋白的表达

M:Marker；1:正常对照组；2：空脂质体转染组；3：阴性转染组；4：ADAM9 siRNA转染组。

2.3 4组细胞侵袭能力的比较见表2。ADAM9 siRNA转染组穿膜细胞数较其他3组明显减少。

表2 4组细胞ADAM9蛋白表达及穿膜细胞数的比较

*：与其他3组比较，P<0.01。

3 讨论

RCCC是成年人肾脏最常见的恶性肿瘤，且近年来发病率呈增高趋势。已经批准上市的分子靶向治疗药物有索拉非尼、舒尼替尼等，还有些肾癌靶向治疗药物正在研究中。靶向治疗为不能手术切除的肾癌或晚期转移肾癌的治疗带来了新的希望, 但这些治疗普遍存在完全缓解率低、有一定的副作用等问题[5]。研究和发现新的更有效的RCCC诊疗作用靶点具有重要的意义。

ADAM9是去整合素金属蛋白酶家族成员之一，研究证实ADAM9在多种肿瘤如乳癌[6]、结肠癌[7]、胰腺癌[8]等中高表达，并与肿瘤的进展侵袭等表型相关。体外研究[9]证实ADAM9基因沉默可抑制乳癌细胞的体外侵袭能力。抑制ADAM9的表达可诱导前列腺癌上皮细胞表型的改变，并增加人类前列腺癌细胞对放疗和化疗的敏感性[10]。ADAM9在非小细胞肺癌中的过度表达与脑转移瘤相关[11]。去势治疗后的前列腺癌组织中ADAM9表达降低，并可作为一个良好的预后指标[12]。研究[3]还表明，ADAM9在肾细胞癌中高表达，并与肿瘤进展、淋巴结阳性状态及肿瘤的远处转移相关。

该研究中作者采用RNAi技术体外沉默人RC-CC 786-0细胞ADAM9的表达，结果显示ADAM9特异性siRNA能够在mRNA水平和蛋白水平有效沉默786-0细胞中ADAM9基因的表达；同时Transwell侵袭性小室实验结果显示，ADAM9特异性siRNA转染后的786-0细胞穿膜细胞数明显减少。上述结果提示，ADAM9与786-0细胞的体外侵袭能力有关，ADAM9特异性siRNA能够有效地沉默786-0细胞ADAM9的表达，并降低786-0细胞的体外侵袭能力。这为RCCC的靶向治疗提供了新的研究思路。

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(2013-04-11 收稿 责任编辑 王 曼)

Effect of ADAM9 targeted siRNA on ADAM9 gene expression and invasion capacity of renal clear cell carcinoma 786-0 cells in vitro

ZHANGXinheng1),MAYaohui1),SHANZhongjie2)

1)OfficeforGraduateStudents,XinxiangMedicalCollege,Xinxiang473003 2)DepartmentofUrology,thePeople’sHospitalofZhengzhouCity,Zhengzhou450003

renal clear cell carcinoma；a disintegrin and metalloprotease 9；invasion

Aim: To explore the effect of a disintegrin and metalloprotease 9(ADAM9) targeted siRNA on ADAM9 gene expression and invasion capacity of renal clear cell carcinoma 786-0 cells. Methods:ADAM9 specific siRNA was designed and synthesized.786-0 cells were divided into 4 group:normal cultured group, LipofectamineTM2000 transfection group, unrelated sequence siRNA (NC siRNA)transfection group and ADAM9 specific siRNA transfection group. RT-PCR was applied to detect ADAM9 mRNA in 786-0 cells after transfection for 24,48,and 72 h.ADAM9 protein was detected by Western blot after transfection for 48 h， and cell invasion was detected with Transwell. Results: The expression of ADAM9 mRNA in ADAM9 specific siRNA transfection group after transfection for 24,48,and 72 h were lower(F=47.945，180.456,60.978，P<0.001),and ADAM9 protein expression and invasion capacity were significantly lower after transfection for 48 h(F=142.816,45.389，P<0.001).Conclusion: ADAM9 specific siRNA can silence ADAM9 gene in 786-0 cells and inhibit its invasion.

R737.11

10.3969/j.issn.1671-6825.2014.01.016