α1肾上腺素受体亚型对脊髓损伤大鼠膀胱排空的调节作用

杨立民，李健夫

辽宁医学院附属第一医院骨科 锦州 121000

α1肾上腺素受体亚型对脊髓损伤大鼠膀胱排空的调节作用

杨立民，李健夫

辽宁医学院附属第一医院骨科 锦州 121000

脊髓损伤；肾上腺素受体；膀胱；大鼠

近年来，随着车祸等意外事故的增加，脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)发生率逐年升高，尤其对于年轻患者，提高损伤后的生活质量成为目前亟待解决的问题。SCI后，排尿中枢受到损害或中断，从而导致尿潴留及排尿功能障碍[1]，其中膀胱的并发症尤为困扰患者日常生活的难题。研究[2-5]发现，α1肾上腺素受体亚型a、b和d在尿道和膀胱均有分布，并对调节膀胱排空起着重要的作用。作者观察了α1肾上腺素受体亚型在大鼠SCI损伤模型膀胱组织中的表达变化，为用其治疗SCI后尿潴留及排尿困难提供理论支持。

1 材料与方法

1.1动物分组及SCI模型的建立选取3个月龄成年健康SD雌性大鼠20只，体重240～250 g，采用随机数字表法分为SCI组与假手术组，每组10只。SCI组采用改良Allen’s打击法建立T10节段SCI损伤模型[6]：水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，常规消毒、铺巾。以T10棘突为中心纵行切开长约2 cm，逐层分离至棘突显露，切除T10椎板，显露硬脊膜。将薄金属片放在硬脊膜上，将质量10 g的金属物自20 mm高度自由落下，打击金属片，随后立即移开。以大鼠尾部出现卷曲、摆动作为SCI造模成功标准。术毕单笼单只喂养，SCI组膀胱区每天人工按压排尿2次。假手术组仅切开T10全椎板及T9、T11的部分椎板，不行打击处理。

1.2标本取材SCI组与假手术组大鼠饲养4周后处死，取出大鼠膀胱并称重，收集的膀胱组织于-80 ℃冻存。

1.3α1肾上腺素受体亚型mRNA表达的荧光定量PCR检测取冻存的膀胱组织300 mg，液氮下磨成粉末，按照Trizol试剂盒(购自Invitrogen公司)说明书提取总RNA。紫外线分光光度计检测提取物浓度，A(260 nm)与A(280 nm)之比在1.8～2.0，符合要求。参照核苷酸排列，利用Primer premier 5.0设计引物(表1)，以GAPDH作为内参，由上海生工生物工程技术服务有限公司进行相关引物的合成。PCR反应体系：5×Buffer 5 μL，目的基因2.5 μL，上、下游引物各10 pmol oligd(dT)，4 μL dNTP(2.5 mmol/L)，RNA酶抑制剂 1 μL，5 μmol/L MLV逆转录酶，0.5 U尿嘧啶-N-糖基化酶，2×SYBR Green PCR Master Mix，加入DEPC水至25 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；最后72 ℃延伸5 min。分析溶解曲线并测量浓度值，mRNA表达水平采用Ct (2-ΔΔCt)值表示[7]。

表1 PCR引物序列

1.4统计学处理采用SPSS 15.0进行分析，应用两独立样本t检验比较2组大鼠膀胱质量及膀胱组织中α1肾上腺素受体mRNA表达水平的差异，检验水准α=0.05。

1.5结果

1.5.1 2组大鼠造模4周后膀胱质量比较 SCI组膀胱湿重[(0.816±0.037) g]较假手术组[(0.209±0.021) g]增加(t=42.814,P<0.001)。

1.5.2 2组大鼠膀胱组织中α1肾上腺素受体mRNA表达水平比较 见表1。大鼠SCI模型建立4周后，SCI组大鼠膀胱组织中α1a、α1b和α1d肾上腺素受体mRNA表达水平均较对照组下降，其中α1d肾上腺素受体mRNA表达水平下降比率较少。

表2 2组α1a、α1b及α1d肾上腺素受体mRNA表达水平的比较

2 讨论

SCI后，部分患者可出现尿潴留甚至膀胱肥大症状，在某些脊髓横断的患者中，自主排尿由不协调的膀胱与尿道括约肌活动代替[8]。而膀胱内的持续高压可损伤上尿道并导致膀胱肥大[9]。这给SCI患者的日常生活和护理带来了很大的困难。目前关于SCI后膀胱颈与后尿道的相关病理生理学研究较多，而对膀胱本身的相关报道较少[2，10]。该研究结果显示，大鼠SCI 4周后，膀胱质量升高，表明大鼠SCI后膀胱内的持续高压导致了膀胱肥大。

以往研究[11]发现，α1肾上腺素受体各亚型在慢性出口梗阻的大鼠膀胱中表达水平不一，其中α1d表达升高，而α1a表达降低，提示α1d肾上腺素受体有望成为控制膀胱刺激症状的治疗靶点[12]。目前临床上常用选择性α1d肾上腺素受体拮抗剂萘哌地尔和α1a肾上腺素受体拮抗剂西洛多辛治疗下尿路症状。而萘哌地尔不仅可改善排尿症状，还可改善良性前列腺肥大所致的尿潴留症状。

有研究[13]报道，α1a、α1b和α1d肾上腺素受体属于G蛋白家族，其可调节内源性去甲肾上腺素和肾上腺素，从而导致机体器官的平滑肌收缩，提示在大鼠SCI后出现的一系列膀胱症状中，α1a、α1b和α1d肾上腺素受体也发挥了重要的调控作用。

由于3种α1肾上腺素受体亚型具有极其相似的氨基酸序列，因此难以利用特异性强的抗体进行免疫组化或Western blot检测。荧光定量PCR作为检测基因表达水平的方法，可以敏感地检测α1a、α1b和α1d肾上腺素受体mRNA在大鼠膀胱的表达水平。该实验结果显示大鼠SCI 4周后，3种α1肾上腺素受体亚型mRNA在膀胱的表达均下降，其中α1d肾上腺素能受体mRNA的表达下降比率最小。α1d肾上腺素能受体与内源性去甲肾上腺素和肾上腺素密切相关，这也提示其可作为一潜在的治疗靶点，为SCI后存在排尿困难患者的治疗带来希望[12]。

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(2013-01-14 收稿 责任编辑 赵秋民)

10.3969/j.issn.1671-6825.2014.01.038