rhuPAa-melittin的生物活性检测

李 城，金世光，李昌熙，王大新，颜炜群

(扬州大学临床医学院 疼痛科，江苏 扬州，225001)

妇科肿瘤中卵巢癌发病率为第3位,病死率却居首位[1]。晚期卵巢癌患者的五年生存率仅为10%～20%[2]。肿瘤患者治疗失败和死亡的最主要原因是恶性肿瘤细胞的侵袭和转移[3-5]。尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)通过与受体uPAR结合发挥效应，效应强度可被其抑制物PAI拮抗[6]。uPA促进纤溶酶原(PG)转化为纤溶酶(PL)，继而促进迁移细胞尾部ECM蛋白和细胞表面黏附受体的降解，导致细胞尾部的回缩[7]。蜂毒素(melittin)具有镇痛、抗感染、抑制血小板凝集[8]。而且蜂毒素具有抗菌、抗肿瘤、抗辐射、抗艾滋病病毒等诸多生物学活性[9]，具有免疫调节功能，并可对多种肿瘤细胞有直接杀伤作用[10-11]。重组rhuPAa-melittin可能具有双重作用的特点。本研究利用高纯度的rhuPAa-melittin进行人成纤维细胞和卵巢癌细胞进行活性检测，初步探讨rhuPAa-melittin对卵巢癌治疗作用及对正常细胞毒性作用。

1 资料与方法

1.1 实验材料

MTT溶液，0.25%胰蛋白酶消化液，10%胎牛血清H-DMEM培养液，DMS。倒置显微镜IX70(日本OLYMPUS公司)，酶联免疫检测仪DG3022(华东电子管厂)，生物安全柜ScientificModel 1205A(美国FORMA公司)，CO2培养箱(美国FORMA公司)，96孔培养板(美国CORNING公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 复苏及培养人成纤维细胞和人卵巢癌细胞：取液氮罐冻存的人成纤维细胞和人卵巢癌细胞SKOV3，于37 ℃迅速融化。超净台紫外照射开启，用吸管吸出冻存管中的细胞悬液，注入离心管并滴加10倍体积的10%胎牛血清H-DMEM培养液，混合后迅速离心，除去上清液，重复用培养液洗1次。用10%胎牛血清H-DMEM培养液适当稀释后，接种培养皿，置入CO2培养箱，24 h后更换一次培养液。待细胞长满平板后，用0.25%胰蛋白酶消化液，用含10%胎牛血清H-DMEM培养液配成单个细胞悬液，分为4组，各组各加6个平行孔，将细胞培养于96孔板，接种的细胞密度为104(100 μL/孔)。添加受试蛋白，培养时间为48 h。终止培养前4 h每孔加入MTT溶液10 μL (终浓度为0.5 mg/mL)，置37 ℃继续培养4 h。每孔加入溶解液DMSO 100 μL，稍震荡待产物充分溶解，也可将培养板置37 ℃过夜温育。取50 μL上述感受态菌，与上述线性化的重组表达质粒混合，移入0.2 cm电转化杯，冰浴5 min。置电转仪上，选择酵母参数，电转化。立即加入1 mL冰浴的山梨醇，将混合物转到1.5 mL EP管中。28 ℃静置孵育1 h。取50 μL转化后的菌液涂布于含Zeocin(100 μg/mL)的YPD平板上，28 ℃培养箱培养72 h，观察转化子的生长。

1.2.2 比色和摄影：实验分为空白对照组，小剂量组，中剂量组，大剂量组，对人成纤维细胞和人卵巢癌细胞SKOV3添加纯化的rhuPAa-melittin蛋白。受试蛋白的浓度分别为；0、4、8、16 μg/mL。添加受试蛋白48 h后，在酶标仪上波长490 nm处检测每孔的OD值。以蛋白浓度为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生长抑制曲线。

2 结 果

2.1 rhuPAa-melittin对人成纤维细胞和人卵巢癌细胞SKOV3生长作用的影响

不同浓度的受试蛋白，取6组数据的均值，检测其对人成纤维细胞和人卵巢癌细胞SKOV3生长作用的影响。rhuPAa-melittin蛋白的低，中，高剂量组均能明显的抑制人卵巢癌细胞SKOV3的生长。而rhuPAa-melittin蛋白对人成纤维细胞抑制作用不明显。在酶联免疫检测仪OD490测定各孔吸收值

2.2 培养基成分对rhuPAa-melittin发酵表达产量的影响

本实验采用了FM21培养基，且在培养基中添加0.5%的蛋白胨，会使rhuPAa-melittin的表达略有增加，且杂蛋白含量减少表达高峰时间提前。见表1。

表1 不同浓度rhuPAa-melittin对不同细胞生长作用的影响(n=6)

2.3 倒置显微镜观察细胞变化

添加受试蛋白48 h后，倒置显微镜镜检，可明显见到中剂量组、大剂量组人卵巢癌细胞SKOV3大量死亡，细胞出现皱缩、脱落、变圆，凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象(图1)。但在人成纤维细胞组死亡现象不明显(图2)。

3 讨 论

MTT实验广泛用于放射敏感性、免疫学上的细胞刺激、免疫细胞毒性、化学敏感性、细胞因子产生等检测中[12]。重组毒素是利用重组DNA技术产生的杂交细胞毒蛋白，用于选择性杀死癌细胞。重组毒素结构上分细胞毒部分和靶细胞结合部位。细胞毒部分是细胞毒或植物毒素。靶细胞结合部位可能是一种生长因子或单链抗原结合蛋白。本实验重组rhuPAa-melittin在杀伤肿瘤细胞过程中，既可以在卵巢癌细胞内与uPAR结合后，释放melittin杀伤肿瘤细胞，又能与uPAR结合后，与双链活性的uPA竞争uPAR的结合位点从而减弱uPA降解细胞外基质作用，达到抑制肿瘤细胞的黏附、迁移及侵袭作用。

A: 空白对照组 100倍; B: 4 μg/mL rhuPAa-melittin对SKOV3抑制作用 100倍;C: 8 μg/mL rhuPAa-melittin对SKOV3抑制作用 100倍;D: 16 μg/mL rhuPAa-melittin对SKOV3抑制作用 100倍

A: 空白对照组 100倍; B: 4 μg/mL rhuPAa-melittin对人成纤维细胞抑制作用 100倍;C: 8 μg/mL rhuPAa-melittin对人成纤维细胞抑制作用 100倍;D: 16 μg/mL rhuPAa-melittin对人成维细胞抑制作用 100倍

本实验设有空白组、给药组，受试蛋白rhuPAa-melittin分为小、中、大3个剂量组，分别作用于人正常细胞(人成纤维细胞)、人卵巢癌细胞SKOV3。实验表明，人卵巢癌细胞SKOV3组，在4 μg/mL时对细胞抑制率已经达到了66.59%，在16 μg/mL时，细胞已经全部死亡。差异有统计学意义(P<0.05)。而人成纤维细胞组，在4 μg/mL其对细胞的抑制率仅为达到7.3%，

8 μg/mL时抑制率为12.3%，16 μg/mL时抑制率为22.0%。不同浓度的rhuPAa-melittin对人成纤维细胞的抑制作用无显著差异,但有一定的抑制生长趋势。

本实验观察48 h，人卵巢癌细胞SKOV3小剂量组有部分细胞贴壁，约20%细胞出现核质浓缩，细胞变圆，不能贴壁生长，而中、大剂量组细胞明显脱落，出现典型的核质固缩，细胞内有颗粒，团块出现，阴性对照人卵巢癌细胞SKOV3生长状态良好，核质固缩等现象出现。人成纤维细胞分别在小、中、大剂量组中细胞脱落和生长抑制现象不明显，但在大剂量组中发现一些细胞的脱落，有一定的生长抑制趋势。

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